第六章分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术说课.pptVIP

我们的学习相对于工业界在总体上应该有一定的超前性，学习国内外最前沿的东西，然后去比较，了解现实，发现问题，感觉未来，这样大家进入工业界之后才有推动技术进步的欲望和能力。 研究基因功能的各种分子生物学技术 学习目的：为进一步了解生物体内各种生理过程、提供了强有力的技术支持。 在细胞内或外研究基因功能 蛋白质之间的相互作用 认识信号转导通路 蛋白质翻译后修饰加工等 6.1基因表达研究技术 1、基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。 锚定酶识别4个碱基。分离3’端酶解片段并将其分为两份，分别与连接子1和连接子2（均含有IIS类标签酶的识别位点）结合，用标签酶（一种Ⅱ类限制酶，它能在距离识别位点数个或十数个碱基的位置切割DNA双链）如BsmF1酶切，将含有连接子1和2的样品混合后测序分析。 2、RNA的选择性剪接 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。包括：平衡剪接(a)、5’选择性剪接(b)、3’选择性剪接(c)、外显子遗漏型剪接(d)及相互排斥性剪接(e)。 3、原位杂交技术 原位杂交(In situ hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。 RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 图为人肌糖原磷酸酶基因在11号染色体的定位结果。 PCR介导的定点突变方法的优势 1.突变体回收率高 2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引入突变 3.可在同一试管中完成所有反应 4.快速简便 6.2 基因敲除技术 1、基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 3、体外蛋白质相互作用技术 （1）Far Western印迹技术 用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测 与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白 的cDNA。 （2）GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 （3）蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。 （4）等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。 （5）免疫共沉淀技术(Co-IP) 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，加入可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 染色质免疫共沉淀ChIP: Chromatin immuno precipitation 主要实验流程：在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目