小四北大学报定稿.doc.doc

转Bt棉不同生长期及不同器官杀虫蛋白 表达量的免疫学方法测定1） 1张小四 1李松岗 1许崇任* 2赵建周 2赵奎军 （1北京大学生命科学学院，北京，100871；2中国农科院植物保护所，北京，100094） 摘 要 转苏云金杆菌（Bacillus thuringensis）杀虫蛋白基因棉花（下称Bt棉）在不同生长期及不同器官上对棉铃虫杀虫活性存在明显差异。目前国内普遍使用生物测试法检测Bt棉对棉铃虫的杀虫活性，但无法定量检测Bt棉中杀虫蛋白的表达量。本实验室建立的酶联免疫学测定方法（ELISA法），可定量检测棉器官内杀虫蛋白的含量。它具有检测周期短，操作简便的优点。用ELISA方法检测Bt棉杀虫蛋白的含量，结果表明，棉叶和花瓣杀虫蛋白含量最高，铃和蕾次之。在棉株生长的后期，各器官杀虫蛋白的含量则有大幅度的下降。 关键词 棉铃虫；Bt棉；杀虫活性；ELISA；生物测试; Bt杀虫蛋白 中图分类号 S433.1；S433 0 引言 棉铃虫（Helicoverpa armigera）是我国棉花生产的重要害虫，常年造成棉花产量损失在15%~20%之间。由于杀虫剂的大量使用，造成棉铃虫抗药性快速增长，严重制约了棉花生产的持续稳定发展，目前迫切需要在综合防治中利用棉花品系自身抗虫性抵御棉铃虫的为害[1]。Bt棉在害虫综合防治中具有对目标害虫的防治效果高、、GFMCryIA基因导入棉花，经分子生物学鉴定，已整和到棉花基因组中。研究表明，Bt棉抗虫性的强弱同棉花器官中杀虫蛋白的含量直接相关。对于Bt棉杀虫蛋白的检测，目前国内常用的方法是生物测试法，以棉铃虫取食Bt棉器官后的死亡率、、、、ELISA，Western blot，试纸条法），它利用抗原抗体特异性结合以及酶的高效催化原理，该法所需样品少，测定时间短，操作程序标准，检测极限高，可对大量样品进行检测[3]。 Bt棉在我国将要大面积推广，在育种和推广过程中，迫切需要一种快速、、Bt棉杀虫蛋白的免疫学检测方法，制备出高效价的抗血清，研制出ELISA检测试剂盒，它对于研究杀虫蛋白在棉花不同时期、、、、国家863计划资助项目（Z17-02-02） *联系人 收稿日期：1999-04-20 建立的ELISA方法，检测了Bt棉不同器官间杀虫蛋白含量的差异，以及同一生长季内，Bt棉不同时期杀虫蛋白含量的动态变化。检测的结果可以对Bt棉育种和Bt棉生长季后期的棉铃虫综合防治提供可靠依据。 材料与方法 供试棉花 转Bt棉及常规棉由山西运城棉花研究所、南京农业大学、中国科学院植保所提供。在生长期不使用任何农药。 ELISA 方法的建立 抗原的制备 培养基：鲜鲤鱼100g，食糖100g，琼脂30g，水1000mL，pH值7.5。 Bt菌种HD-1由中国科学院动物研究所提供。复苏48h后接种，30℃培养至芽孢晶体分离，用双相液体分离法提纯晶体蛋白，制得纯度在95%以上的晶体蛋白[4-9]。冰冻干燥后保存。 动物免疫及抗体的制备 用制备的晶体蛋白作为抗原，常规免疫年龄在6个月、体重在3kg左右的雌性健康青紫蓝兔。晶体蛋白溶于0.015mol/mL NaOH（室温过夜），以10mmol/mL磷酸钠缓冲液(pH7.0)透析过夜。每次免疫每只兔子抗原量为1mg，共3次，第1次加弗氏完全佐剂四足注射，第2次加不完全佐剂背多点注射，第3次不加佐剂耳缘静脉注射，每次免疫之间间隔30d[10,11]。半年后颈动脉取血，4℃冰箱静置让血清充分析出。双相免疫扩散法测得效价为1:64。血清加万分之二的叠氮钠-20℃保存。 建立ELISA方法 在检测方法上，主要作了两个方面的改进，解决了假阳性的问题。一是沉淀样品中的棉酚，降低其对杀虫蛋白检测的干扰；二是去除抗血清中同棉花杂蛋白非特异性结合的IgG，降低检测的本底值[12,13]。 ELISA检测具体步骤如下： 取棉花样品，加0.015mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液充分研磨；8000rpm离心5min，取上清，包被酶标板，37℃保温2.5h；加一抗，37℃保温0.5h；加辣根酶标记的羊抗兔二抗，37℃保温0.5h；最后加TMB底物显色后用2mol/L硫酸终止反应，460nm下测光吸收值（OD值）。 数据处理： 由标准蛋白梯度对应的OD值作出回归直线，再由样品检测的OD值通过回归直线计算出样品的杀虫蛋白含量。 生物测试法 取棉花器官，放入培养器皿中，皿中接1龄棉铃虫（初孵幼虫接入人工饲料上饲养至第2天，即为1日龄）。置于（27+1）℃，光照:黑暗=14h:10h的培养箱，处理3d后初步检查结果，并将存活幼虫分单头饲养以避免相互残杀，处理6d后检查幼虫存活和死亡情