发根农杆菌要点.ppt

农杆菌质粒介导的基因转移系统是植物基因工程中比较完善而有效的方法。在转基因植物中有80％以上是由农杆菌介导转化的，但是其中大部分是由根癌农杆菌Ti质粒介导获得的。1982年Chilton报道发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)能诱导植物产生发状根(Hairy root)，这种发状根又称毛状根，是由发根农杆菌所含有的Ri质粒(Root inducing plasmid)引起的。 与根癌农杆菌相比，发根农杆菌在植物遗传转化方面具有明显的优越性。 用Ti质粒作为基因载体时．由于Ti质粒T-DNA区的癌基因经常造成被转化的植物组织形成肿瘤，阻碍正常植物的再生，为了防止肿瘤的形成，常采用除去Ti质粒T—DNA区癌基因的方法，即“解除武装”，而用Ri质粒作为基因载体时，不需要“解除武装”，从其转化的植物细胞上很容易再生出植株； Ti质粒转化植物产生的瘤组织有可能是一个转化细胞与非转化细胞所构成的嵌合体，而发根农杆菌转化植物产生的毛根来源于同一个植物细胞，因此，毛根的每一个细胞都是转化的； 毛根的无性系可以通过激素的自主性进行选择； Ri质粒转化植物所产生的毛状根分化为正常植株的分化率高，倍性稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物细胞核染色体上插入一个T-DNA拷贝的株系。 毛状根具有生长迅速、多分支、数量大、没有向地性，拥有亲本植物的特征次级代谢途径，能形成有价值的次生代谢产物等特点。 由毛状根再生的植株经常表现出节间短、顶端优势比较弱、叶皱等特殊特征，这对于植物转化体的筛选非常有利。 发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。 Ri质粒为根诱导质粒(Root Inducing Plasmid)；Ri质粒的大小为200～800 kb，它含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因，在结构上有致毒区(Vir区)，转移进入植物细胞核的T-DNA区及其内部的冠瘿碱合成功能区等。 根据其合成冠瘿碱的不同，可将Ri质粒分为4种类型： ①甘露碱型(Mannopine Type)，合成甘露碱及其酸、农杆碱酸与农杆碱素A； ②黄瓜碱型(Cucumopin Type)，合成黄瓜碱； ③农杆碱型(Agropine Type)，合成农杆碱及其酸、甘露碱及其酸、农杆碱素A； ④米奇矛型(Mikimopine Type) Petit等发现含农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌较甘露碱型、黄瓜碱型和米奇矛型有更为广泛的宿主范围。 Ri质粒通过T-DNA转移到被侵染植物中，使其生成毛状根。农杆碱型Ri质粒上的T-DNA呈不连续分布，TR-DNA及TL-DNA上的基因与毛状根的形成有关，同时也影响着再生植株地上部分形态和一些生理性状。TR-DNA的基因tmsl和tms2能指导IAA的合成，因此转化生成毛状根在培养时不需要添加生长激素。所有Ri质粒Vir区的保守性很高，在转化过程中，Vir区上的基因不发生转移，但它对T-DNA的转移起着极为重要的作用；在通常状态下，Vir区的基因处于抑制状态，当发根农杆菌感染植物时，受损伤植物合成乙酰丁香酮，使Vir区抑制状态的基因被激活，产生限制性核酸内切酶，在酶的作用下产生T-DNA链，并引导T-DNA链与细菌细胞膜上的特定部位结合，然后向植物细胞转移，进入植物细胞核内，T-DNA随后整合进入植物细胞基因组。 发根农杆菌感染植物的方法 发根农杆菌诱导植物毛状根生成的方法主要有以下3种： 植物体直接接种法 在植物无菌苗、茎杆上划出伤口，将发根农杆菌接种在伤口处，培养一段时间后，在接种部位产生毛状根。 外植体接种法 取植物的无菌外植体，与发根农杆菌共同培养，在选择培养基上进行继代培养，发根农杆菌被杀死，转化细胞产生愈伤组织，并诱导生成毛状根。 原生质体共培养法 将愈伤组织制备成原生质体，与发根农杆菌共同培养，在含抗生素的选择培养基上对转化细胞进行筛选，得到转化克隆，再在分化培养基上得到完整的植株。 发根的鉴定 形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝， 多根毛，无向地性 组织水平：GUS 活性的测定或 NPTII 酶的检测 细胞水平：冠瘿碱的测定 分子水平：Southern Blot, PCR等方法 影响发根农杆菌转化的因素 发根农杆菌 1.1 菌株类型 目前采用的发根农杆菌主要有天然农杆碱型的A4、ATCCl5834、16834、LBA9402及1601、R1000、R1200等人工构造质粒；还有黄瓜碱型的2635、2657、2659等；以及甘露碱型的5196、TRl01、TR7等，每一种菌