第8章基因工程剖析.ppt

第八章 基因工程 一个基因一个性状？不一定。例如肤色的控制至少有三个基因参与。 基因决定性状，环境还起不起作用？在基因型确定的基础上, 环境常常会影响表型。 细菌的接合转化 重组DNA技术的操作过程 切 接 转 增 检 (1)获得目的基因 到哪里去找目的基因？一般来说，人的基因,要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从小鼠的组织细胞中去找。 从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因,称为基因文库。文库中基因总数 就人来说约有 3 万个基因。如何从中把需要的基因找出来？ 采取“钓”的办法。这个办法通常称为印迹法。 Southern印迹杂交(southern blot )★★★ Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性(NaOH)，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干(80℃烤4~6h)固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交(杂交一般在高盐浓度和68 ℃下进行数小时或十几小时)，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 由英国分子生物学家E. M. Southern发明 Southern blotting process 内切酶切开DNA 电泳分离DNA片段 印迹转移 与放射性探针杂交 放射自显影 样品(血液)中的DNA分子 将变性DNA片段转移到硝酸纤维素膜上 探针可以是DNA，也可以是RNA； 可以用放射性同位素标记，也可以用生物素或荧光素标记。 (1)基因文库－ DNA 用限制性内切酶处理。(2)DNA 片断混合物通过电泳分离。(3)电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。(4)用已知小片断DNA 作为探针，互补结合需要找的基因片断。(5)探针DNA 片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。 印迹法的主要步骤： 印迹法的关键是“分子杂交”：利用碱基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片断去寻找(“钓”)大的未知的基因片断。 探针 DNA 片断从何而来？根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中 N－端 15～20 个氨基酸序列，按三联密码转为 40～60 核苷酸序列，人工合成，即为探针 DNA 片断。 Northern印迹杂交和Western印迹法 应用类似的方法也可用于分析RNA。即将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜上再进行杂交。这种方法称为Northern印迹杂交。 用类似的方法，根据抗原与抗体可以结合的原理，也可以分析蛋白质，这种方法称为Western印迹法。 (2) 目的基因的扩增 用上面的方法“钓”出的目的基因，数量极少，所以，接下来必须经过扩增，亦称为基因克隆。获得相当数量的目的基因后，才能继续下一步操作。 —— 把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。 PCR 技术★★★ 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )又称为PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。 1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术； 1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖。 P C R 操作流程 90 0 C 50 0 C 70 0 C 第一步 —— 90 ℃高温下，使混合物的DNA 片断因变性而成单链。第二步 —— 50 ℃ 温度下，引物 DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步 —— 70 ℃温度下，由合成酶( DNA 高温聚合酶)催化，从引物开始合成目的基因 DNA。 PCR 反应分三步完成： PCR 的三个步骤为一次循环，约需5～10 分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。 (3) 构造重组 DNA 分子 首先要有载体。 载体有好几种，常用的有： 质粒——环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。 噬菌体DNA——线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。 用质粒构建重组DNA分子 用噬菌体DNA构建重组DNA分子 其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要的关键酶叫限制性内切酶。