第九讲 头孢菌素类综述.pptVIP

头孢菌素C Cephalosporin C 头孢菌素C 1 头孢菌素C概述 2 头孢菌素C的生物合成 3 菌种选育与保存 4 发酵过程优化 5 头孢菌素C的分离纯化工艺 6 7-ACA的酶法制备与直接发酵生产 1 头孢菌素C概述 头孢菌素C是由Newton和Abraham于1953年继青霉素之后，在自然界中发现的第二种类型的β-内酰胺类抗生素。 头孢菌素C与青霉素有许多共同特征，抗菌作用机制也是抑制细菌细胞壁肽的合成，对人体安全无毒。 头孢菌素C的化学结构 头孢菌素C概述(2) 头孢菌素C抗菌活性低，受半合成青霉素启示，通过结构改造获得了很多更有效的半合成头孢菌素，因此头孢菌素C是目前各种半合成头孢菌素的起始原料之一。 在温和的条件下，用酸水解头孢菌素C可得除去侧链的母核，即7-氨基头孢霉烷酸（7-ACA）。 头孢菌素C概述(3) 经酸水解或乙酰酯酶处理头孢菌素C，则生成去乙酰头孢菌素C（简称DCPC，3位-CH2OH）。用钯碳及氢使头孢菌素C氢化可得到去乙酰氧头孢菌素C（DOCPC或7-ADCA，3位-CH3）。 2 头孢菌素C生物合成 前体氨基酸的生物合成 头孢菌素C的生物合成 头孢菌素C的结构 前体氨基酸的生物合成 α-氨基己二酸（α-AAA）的生物合成（葡萄糖、氨水） 缬氨酸（Val）的生物合成（葡萄糖、氨水） 半胱氨酸（Gys）的生物合成（葡萄糖、氨水、SO42－） 头孢菌素C的生物合成(1) 头孢菌素C也是由α-氨基己二酸(α-AAA), 半胱氨酸和缬氨酸经三肽途径生物合成ACV三肽，而且在异青霉素N以前的阶段和青霉素的生物合成完全一样。 此后，经顶头孢霉产生的异构酶作用，将异青N（IPN）转化为青霉素N，再由扩环酶（脱乙酰氧头孢菌素C合成酶）催化扩环生成脱乙酰氧头孢菌素C，最后通过羟化和转乙酰基反应得到头孢菌素C。 3 菌种选育与保存 (1) 原始亲株：顶头孢霉M8650，全世界所有高产菌差不多都是由它反复诱变、筛选得到的。 出发菌株 通过诱变在完全培养基上获得蛋氨酸营养缺陷株，然后转入加有各种含硫化合物（如硫酸盐）以代替Met的基本培养基，可筛选出不需要加入Met的高产突变株，从而降低成本。 菌种选育与保存 (2) 原生质体融合也是高产菌株选育的一种有效方法。顶头孢霉的细胞壁对β-葡萄糖苷酸酶敏感，可用Helix pomatia 产生的这种酶进行破壁，形成原生质体。聚乙烯醇能促进原生质体的融合和重组细胞的再生。 菌种选育与保存 (3) 由于扩环和羟化是头孢菌素C生物合成途径限速阶段，因此可用现代基因工程技术构建含克隆的扩环/羟化酶基因的质粒，将其转入工业生产菌株中，获得显著提高头孢菌素C生产能力的基因工程菌。 菌种选育与保存 (4) 菌株的保存可以采用冷冻干燥法或液氮法。由于保存的大部分是营养菌丝，长期保存后生命力的恢复较差，故经过保存的菌株应对存活细胞进行计数，并在摇瓶及中试条件下开展能力试验，挑选复壮的菌落作为生产用种子。 4 发酵过程优化 培养基 通气搅拌 菌丝生长速率 菌丝形态 发酵终点 培养基(1) 氮源 玉米浆已经被证明是一种优良的氮源，它提供各种丰富的氨基酸、肽、蛋白质和微量元素，起始用量一般为2~6g/L； 其它氮源有花生饼粉、硫酸铵、氨、尿素等。 当基础培养基中的氮源消耗到一定浓度时，要不断补加氮源（硫酸铵或氨），以维持发酵液中氨氮含量在0.5~0.7g/L之间。补氨还能起到控制pH的作用。 培养基(2) 碳源 可使用葡萄糖、糊精、淀粉或植物油。植物油通常作为流加碳源，而其它碳源加入基础培养基中。添加无机盐以满足菌丝生长对Mg2+、PO43-等的需要，特别是当采用含有有机物少的稀薄培养基时。 通气搅拌(1) 在头孢菌素C发酵中要求较高的氧传递速率，以维持所需的溶氧浓度。因为三肽的环化、青霉素N的扩环和脱乙酰氧头孢菌素C的羟化都是氧化反应。 为了维持所需的溶氧浓度，一般搅拌输入功率为4 kW/m3(发酵液)以上。 通气搅拌(2) 根据溶氧的变化情况，可将发酵过程分为两个阶段。 第一阶段是菌丝量高速增长、溶氧迅速下降的生长阶段。这一阶段必须在溶氧成为限制因子之前结束，它可以通过使碳源成为限制因子来达到。 通气搅拌(3) 在生产的第二阶段，要严格控制油的流加量，使溶氧始终保持在25％饱和度以上。 一旦加油过多，可以提高搅拌转速和发酵温度。以加速氧的传递和油的消耗，避免溶氧过分下降。 菌丝生长速率 实验表明，用豆油作为生长限制基质时，比生长率则与比生产率成正比；比生长率由0.01/h提高到0.04/h，比生产率增加到2倍。 因此用葡萄糖碳源可调控菌丝生长率。 菌丝形态 在头孢菌素C发酵过程中，产生菌顶头孢霉呈现明显的形态。在快速生长期，菌体以细长到丝状为主； 随着营养的消耗和比生长