RNA提取和鉴定.pptVIP

实验一、RNA提取和鉴定 真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。 一些公司推出的总RNA提取试剂盒（Trizol），可以用来制备高质量的RNA。该总RNA纯化系统采用的主要RNA酶抑制剂是异硫氰酸胍(GT)，有的还有β-巯基乙醇。整个操作都在冰浴下进行。从复合体中纯化RNA，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。随后用乙醇洗涤沉淀得到RNA。 1、取0.1-0.15 g新鲜材料，液氮研磨，加入盛有1 ml Trizol的1.5 ml EP管中，剧烈震荡15 s，冰上放置5 min。 2、加入200μl氯仿，剧烈震荡15 s，冰上放置3 min。 3、4℃，12000 rpm，离心15 min。 4、取上层水相，加入500μl异丙醇，冰上放置20 min，或-20℃ 30 min以上。 5、4℃，12000 rpm，离心15 min，于管底形成胶状沉淀。 6、去上清，于沉淀中加入100μl灭菌的DEPC水，溶解后，用100μl（等体积）25：24：1的酚：氯仿：异戊醇进行抽提5 min。4℃，12000 rpm，离心15 min。 7、取上清，加入1/10体积的3 M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇，沉淀1 h。4℃，12000 rpm，离心15 min。 * * 一、实验原理 （一）RNA提取前药品和器具的准备 实验中用到的一切器具用DEPC+H2O(ddH2O中含有DEPC 0.1%V/V)处理。用DEPC+H2O处理RNA提取用的枪头和EP管及玻璃器皿的方法： （1） 用DEPC+H2O浸泡枪头，可在烧杯或广口瓶中进行。DEPC要挥发（有毒）可用一次性PE薄膜手套封口，用橡皮筋扎紧，置37℃温箱内处理12小时以上，倒去DEPC+H2O（DEPC+H2O回收，可重复使用）。 二、实验操作 （2） 枪头仍留在烧杯或广口瓶中，一次性PE薄膜手套改换成洁净的牛皮纸，橡皮筋扎紧后，进行常规高压灭菌后，倒置烧杯或广口瓶于80℃烤箱中烤干。EP管及玻璃器皿可同样处理。 （3） 研钵处理：洗净后用蒸馏水清洗2-3遍，晾干后倒入2/3体积的95%工业酒精，放入药匙和杵，点燃酒精，待酒精烧干后，稍稍冷却后倒入液氮研磨样品。 （二）Trizol法提取RNA 8、弃上清，沉淀用1 ml 75%的乙醇洗2次（上下倒置几次），要贮存-70℃，可停留这一步。 9、4℃，7500 rpm，离心5 min。 10、弃上清（弃得越干净越好），在超静台吹干约5 min，溶于适量DEPC处理过的灭菌水中（10μl），-20℃保存备用（最好-70℃保存）。 1、研钵冷却后，倒入适量液氮，加入约0.15 g植物材料，充分研磨后快速转入一个含有300 μl 的4 M GT的1.5 ml聚丙烯管中，剧烈震荡摇匀。 2、加入30 μl 2 M NaAc（pH4.8-5.2）摇匀，加入300 μl酸酚（水饱和酚pH5.0），摇匀，加入100 μl 三氯甲烷，摇匀，冰上放置15 min。 3、12000 rpm 4℃离心15 min，吸取上清，放入另一个新离心管中，加入等体积异丙醇，于冰上放置15 min。 （三）GT法提取RNA 4、12000 rpm 4℃离心10 min，弃上清，将沉淀悬浮于含100 μl 4M氯化锂的1.5 ml EP管中，于-20℃放置1小时或更长时间。 5、12000 rpm 4℃离心10-15min，将沉淀溶于0.4 mlDEPC水中，加入1/2体积氯仿和1/2体积酸酚，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min。 6、上清液加入1/10体积的3 M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇于-20℃放置1小时或更长时间。 7、12000 rpm 4℃离心15 min，超净台吹干，沉淀溶于10μl DEPC水中。 8、RNA贮于-80℃。 1、全部实验过程中均需戴手套操作。2、4℃低温下操作。3、尽量不说话。 三、注意事项