基础生物化学-蛋白质重点.ppt

亲和层析法以其非常高效的纯化能力尤其受到重视。亲和层析依据要纯化的某蛋白对另一物质(统称为配基)特殊的生物亲和性，如酶对其底物、抑制剂，抗体与其抗原，激素与其受体，凝集素与其专一结合的糖和糖蛋白等都有很高的亲和性。将配基连接在载体上制备成亲和层析柱，加入待纯化的蛋白质混合液，杂蛋白不能与配基结合而随溶剂流出，需要的蛋白质与配基形成络合物留在柱上，再用洗脱液将其洗脱。 2.5.2 蛋白质的胶体性质 蛋白质分子量很大，一般在10000 ~ 1000000之间，在水溶液中分子直径在1~100nm之间，具有胶体溶液的性质，如不能通过半透膜、电泳现象等。因此可用透析和电泳的方法来分离、纯化蛋白质。 维特蛋白质胶体稳定性的因素 水化层：球状蛋白质表面多亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH2 等） ，具有强烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白质颗粒的表面形成一层很厚的水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。 同性电荷：在非等电点时蛋白颗粒带有同性电荷，相互排斥。 2.5.3 蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质是由AA组成的高分子化合物，具有许多游离的氨基、羧基、咪唑基、胍基、巯基、酚基等，因此与AA一样，能象酸一样解离，也能象碱一样解离，也是两性电解质。 当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相等，即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质的等电点(isoelectric point)。 蛋白质在等电点时，因没有同性电荷排斥，故最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力结合成较在的聚集体沉淀出来（分离提纯蛋白质的方法）。 电泳：带电质点在电场中向电荷相反的电极泳动的现象。电泳方法是实验室、生产、临床诊断等常用来分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度的手段。 2.5.4 蛋白质变性作用 天然蛋白质因受物理及化学因素的影响，使其分子原有的天然构象发生变化（次级键破坏），从而导致理化性质和生物活性发生改变，称为变性(denaturation)。 变性蛋白质只有空间构象的破坏，蛋白质变性本质是次级键，二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。 引起蛋白质发生变性的因素 化学因素：强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)、苦味酸、浓乙醇等。 物理因素：加热(70℃~100℃)、加压、脱水、剧烈振荡或搅拌、紫外线、X-射线照射、超声波、高压处理等。 变性因素常被应用于消毒及灭菌；保存蛋白质制剂时应注意防止蛋白质变性。 变性蛋白质的特点： ①生物活性的丧失； ② 包藏在分子内部的侧链基团暴露； ③理化性质改变：如变性后疏水基外露，溶解度降低形成沉淀。但在碱性溶液中或有变性剂存在时不沉淀，除去变性剂后则沉淀。球状蛋白质在变性后，分子伸展不对称程度增加，粘度加大，扩散系数降低； ④生化性质改变，蛋白质变性后分子结构伸展松散，因此，变性蛋白质比天然蛋白质更易受蛋白酶作用，这就是熟食易于消化的道理。 复性(renaturation)：当变性因素去除后，有的变性蛋白质又可缓慢重新回复到天然构象，此现象称为蛋白质的复性。 例如，核糖核酸酶在β-巯基乙醇和8M尿素作用下发生的变性，经过透析去除尿素和β-巯基乙醇，酶蛋白又可恢复其原来的构象，生物学活性也几乎全部恢复。 许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。 2.5.5 蛋白质的沉淀反应 破坏蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会凝聚成大的质点而从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)。 稳定蛋白质亲水胶体的因素是颗粒表面的水化层和电荷。若除掉这两个稳定因素（如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂），蛋白质便容易凝集析出。高浓度中性盐、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂等都可引起蛋白质沉淀。 ①中性盐 加入高浓度的中性盐（如[H4N]2SO4、Na2SO3 、NaCl等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质产生沉淀。这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析(salting out)。盐析法是最常用的分离蛋白质的方法。 盐溶与盐析： 盐溶（salting in）：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。由于蛋白质分子吸附某些盐类离子后，带电表层使蛋白质分子相互排斥，而蛋白质分子与水分子的相互作用加强，因此溶解度提高。 盐析（salting out ）：在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。 由于大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏了蛋白质分子表面的水化层，同时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质沉淀。 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。 用半饱和