免疫组化幻灯教学版.ppt

掌握免疫组化技术的概念、原理、优点、ABC染色的基本操作，了解免疫组化染色技术的其他几种方法及临床应用。 学习重点 主要讲述的内容 概述 免疫组化的概念和优点。 免疫组化染色前的准备。 抗体的标记 如何降低非特异性染色。 免疫组织化学方法 免疫组化结果的判定以及染好切片的关键 免疫组织化学的应用。 免疫酶组织化学染色图片举例。 抗原修复 常规石蜡切片的标本一般均采用甲醛固定，甲醛固定的部分组织细胞免疫组化的敏感性明显降低，主要原因为甲醛固定过程中形成的醛键以及甲醛固定导致的蛋白与蛋白之间的交联，均会封闭部分抗原决定簇，同时甲醛的这种交联作用会影响细胞膜的通透性，使抗体分子难于渗入细胞内，从而影响染色效果。 ?化学方法(酶消化方法) 胰蛋白酶(trypsin)消化方法 酶浓度一般为0.05%~0.1%, 胃蛋白酶(pepsin〉消化方法 0.4%胃蛋白酶 链霉蛋白酶(poruse)消化方法 浓度为0.1%。  ?物理方法 单纯加热方法; 高压加热方法; 微波方法 微波方法 将切片常规脱腊后水洗，放入盛有枸橼酸缓冲液的容器中，置微波炉加热沸腾，时间为5min×2次。 加热完毕，将切片缸在室温下放置，使缸内温度自然下降至40℃左右，蒸馏水洗，进入免疫组化染色。 抗体的标记 为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记，利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大，并转换成可见的荧光或呈现出颜色。 免疫组化染色中比较成熟的标记物有：异硫氰酸荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白、胶体金、葡萄球菌A蛋白、生物素、放射形核素等。 由于标记物和抗体结合，酶促反应的定位就间接地显示抗原-抗体反应的定位。 免疫组织化学染色中的非特异性着色 凡不属于特异性抗原抗体反应所呈现的染色。 原因： 组织方面：自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等。 试剂方面：抗体不纯、标记酶或荧光不纯或标记过量等。 免疫组化染色方法 (1)免疫荧光法 (2)免疫酶标法 (3)免疫胶体金法 免疫荧光法的基本原理 将已知的抗体分子标记上荧光素，再与相应的抗原起反应，形成的抗原抗体复合物因带有荧光素，在荧光显微镜下可以观察到发出荧光的免疫复合物结合部位，从而做出判断。 作为病理诊断，免疫荧光法具一些不足之处,如： (1)特异性抗体用量大； (2)敏感性及特异性不够理想； (3)荧光强度随时间延长而慢慢减弱； (4)需要昂贵的特殊显微镜。 免疫酶组织化学方法  理想的标记酶的要求 酶的活性高且稳定 终产物稳定，不扩散，有良好的定位 酶和抗体的结合不影响抗原和抗体的结合 在组织中和体液中不存在内源性的酶及其底物 辣根过氧化物酶（HRP） 稳定性好，在PH3.5～12范围, 60℃加热15分钟不失活 穿透性强，溶解度大. 底物为H2O2，DAB（3′，3-二氨基联苯胺）为供氢体,反应式为： HRP. H2O2 +DH2 HRP+D+2H2O 碱性磷酸酶（AP） ABC三步法(亲和素-生物素-过氧化物酶连结法)  ABC法是利用亲和素（卵白素）与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质,先将生物素与辣根过氧化酶（HRP）结合，形成生物素化HRP(B液)，然后与亲和素(A液)按一定的比例混合，形成ABC复合物。用生物素化的二抗与一抗结合，再与ABC复合物结合，最后用底物显色剂显色。 优点： 敏感性高，约为PAP法的8-40倍； 特异性强，非特异性背景着色低； 方法简便，应用范围广。 步骤： 石蜡切片脱蜡至水； 缓冲液洗； 3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶; 缓冲液洗； 滴加非免疫动物血清20min 步骤 ?直接滴加第一抗体； ?PBS冲洗； ?滴加生物素化的二抗； ? PBS冲洗； ?滴加ABC复合物； ?PBS冲洗； ?DAB显色。  ? SP法或LSAB、SABC法(链亲和素-过氧化物酶连结法) 用链亲和素（SA）代替ABC复合物中的卵白素蛋白（亲和素）即形成SP法。染色原理同ABC法。 LSAB法中由于采用链亲和素，避免了与组织中内源性生物素结合的可能，所以背景染色低、放大效果高。其标记技术比PAP、ABC法更为简便、敏感、特异，且价格较低而在我国逐渐普及。 IGS法(免疫金法)： 用金标记代替酶标记。  IGS的基本原理是先用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体或A蛋白再与特异性抗体结合，再用乳酸银处理，银颗粒沉积在金颗粒上，还原银显示为黑褐色。 免疫组化结果的判断原则 ?每批染色都要