基因工程的重组连接剖析.pptVIP

基因工程的重组连接 ——DNA连接酶 DNA连接酶 概念：DNA连接酶存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3 ’羟基和5’磷酸基团共价形成3 ’ -5’磷酸二酯键，使断开的DNA切口连接起来，因此它在DNA复制、修复以及体内体外的重组过程中起重要作用。 分类： E.coli DNA ligase:需要烟酰胺腺嘌呤（NAD+）作辅助因子， NAD+ +酶?酶-AMP，同时释放出烟酰胺单核苷酸（MMN） ?活化的酶复合物在DNA切口处修复磷酸二酯键，并释放AMP。 T4 DNA ligase：由T4噬菌体基因编码，分子量约为60KDa。其活性以ATP为辅助因子，它与酶形成复合物，并释放磷酸焦磷酸基团。 DNA连接酶 目前基因工程所使用的DNA连接酶多是来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶，因为它与大肠杆菌DNA连接酶相比，具有以下特点： 修复双链DNA上的单链缺口（二者均相同），这是两种DNA连接酶的基本特征； 连接DNA-RNA杂交双链上的DNA或RNA缺口，其中后者反应速度较慢； 连接完全断开的2个平头双链DNA分子，反应速度通常是粘头连接的1/10-1/100，因此这种反应属于分子间连接，反应速度依赖于2个DNA分子与酶之间的随机碰撞，所以速度较慢。但是若适当提高酶量以及底物浓度，或在反应体系中加入适量的一价阳离子（如150-200mM NaCl)和低浓度PEG可以明显改善平头DNA分子的连接。 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接反应的影响因素 1.酶活单位：1国际单位（U）的T4-DNAligase 的定义为：在最佳缓冲系统及15℃，1h内完全连接1μgλ-DNA的HindⅢ片断所需的酶量。 2. T4-DNAligase的缓冲条件： 50~100mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 10mmol/L MgCl2 5mmol/L DTT ?1mmol/L ATP 一般连接反应的总体系控制在10-15ul内。同样T4 DNA连接酶储藏于50%的甘油中，而过高的甘油浓度对酶活也有抑制。因此酶的总用量也不要超过总体系的1/10。 DNA连接酶 影响T4DNA连接酶连接反应的因素： 温度：大多数限制性内切酶产生的粘性片段的Tm为15℃，另一方面T4DNA连接酶本身最合适的反应温度为37℃，5℃以下活性大大下降。因此在实际操作中，我们多采用过夜15℃-16℃连接； 离子浓度：过高或过低的离子浓度会影响反应速度； DNA片段： DNA末端的性质 如果为粘性末端可以看作分子内的连接反应；但如果为平头DNA分子之间连接，则是分子间连接，速度大大下降； DNA浓度、DNA片段的大小 分子内连接：片段与载体的摩尔数比=2：1—3：1 分子间连接：51.1/(DNA浓度：g/L)?(分子量：dalton)的值如果小于1则容易发生分子间的连接反应 一般性规律是：DNA浓度越稀越容易发生分子内连接反应。 DNA连接酶 普通连接反应的设计： 总体系 10ul 10×buffer 1ul Vector (3k;500ng/ul) 1ul DNA fragment(500bp;50ng/ul) 3-5ul Ligase 0.5-1ul H2O 加水至10ul DNA连接酶 重组率及其影响因素： 重组率：是指连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子与所投入的载体分子数之比； 重组率与连接效率的关系： 一般情况下，连接效率越高，重组率越大（针对定向克隆而言）； 如果外源DNA片段与载体DNA分子均是经过一种限制性内切酶处理，那么重组率和连接效率就成为了两个彼此独立的事件了。因此在此过程中，连接产物就成为两种，即重组分子和载体自我环化或空载。此时的连接效率就高于重组效率。因此有些措施能够提高连接效率但是并不意味着能够提高重组效率，如增加酶的用量，延长反应时间等； 如何提高重组率： 提高外源DNA片段和载体DNA分子之比（2-10：1 ） ，这样就可以增加外源DNA片段和载体分子之间碰撞的机会；减少载体分子之间以及载体DNA两个末端之间的接触，从而降低载体自我环化；