8-真菌形态.pptVIP

实验八 真菌形态、酵母型真菌的鉴定 一 实验目的： 1. 掌握墨汁负染色、乳酸酚棉蓝染色的原理和方法。 2. 掌握白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、新生隐球菌等真菌的形态和简单生化反应。 二 实验内容 （一）形态观察： 观察三种真菌在沙保弱培养基上的菌落形态和镜下形态。 1.真菌：是以腐生或寄生方式生存，按有性或无性方式繁殖，细胞核高度分化，有核仁和核膜，胞浆内有完整的细胞器，细胞壁由几丁质或纤维素组成，不含叶绿素，不分化根、茎、叶的真核细胞型微生物。 2.真菌培养营养要求不高，常用沙保弱培养基接种， 最适PH4.0-6.0，温度22-28℃（深部真菌37℃）； 鉴别培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂、酵母浸膏琼脂、蔡氏琼脂等。 3.真菌分为单细胞真菌和多细胞真菌。 隐球菌和假丝酵母菌都属于单细胞真菌，以出芽方式繁殖。 酵母菌出芽繁殖 检查方法真菌检查的方法主要有： (1)直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。取标本置玻片上，加一滴10％KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。可用于检查有无菌丝或孢子，但不能确定菌种。 (2)墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。方法是取一小滴墨汁与标本(如脑脊液)混合，盖上盖玻片后直接镜检。 (3)涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常用PAS染色，多数真菌可被染成红色。 (4)培养检查：标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(Sabouraud agar)上，置室温或37℃培养1～3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。 隐球菌 在组织中呈圆形或卵圆形，直径4-6μm， 外周有宽厚荚膜，荚膜较菌体大1-3倍，折光性强，一般染色法不易着色。 常采用墨汁负染色法，在黑色背景下可镜检到透亮菌体和宽厚荚膜，非致病性隐球菌无荚膜。 将标本接种在沙氏培养基上，病原性隐球菌在25℃和37℃孵育的可生长，而非病原性隐球菌在37℃时不生长。 白假丝酵母菌 形态： 圆形或卵圆形单细胞真菌， 直径3-6μm，革兰阳性， 着色不均匀。出芽方式繁殖， 在组织内可见芽生孢子、 假菌丝，在玉米粉培养基中 可长出假菌丝和厚膜孢子。 培养： 需氧。室温或 37℃甚至42℃生长良好 菌落灰白色或奶油色，表面光滑，带有浓厚的酵母气味。有大量向下生长的营养假菌丝，呈类酵母型。 单细胞真菌菌落形态： 类酵母型： 与酵母型相似，但形成假菌丝，伸入培养基中，如假丝酵母菌。 酵母型： 外观光滑、质地柔软、呈乳酪样，与细菌菌落相似，如隐球菌。 新生隐球菌墨汁负染色： （1）制片：取洁净载玻片一块，滴加1滴优质墨汁，挑取少量菌与之混匀，然后将一洁净盖玻片盖在混合液上，注意勿留气泡。 （2）显微镜检查：用低倍镜和高倍镜观察。 新生隐球菌为圆形或卵圆形酵母细胞，有芽生孢子， 细胞外有一层胶质样荚膜， 一般厚度与菌体相等。 菌体和荚膜不着色， 透亮，背景为黑色。 乳酸酚棉蓝染色： 真菌染成蓝色，适用于所有真菌 方法：取洁净载玻片三块，分别滴加1滴乳酸酚棉蓝染液，用接种环分别挑取少量真菌菌种于染色液中，混匀，加上盖玻片（加热或不加热）后用低倍镜和高倍镜观察。 （二）芽管形成试验： 1.原理： 白假丝酵母菌可形成芽管， 其他假丝酵母菌一般不形成芽管。 （并非所有的白假丝酵母菌都形成芽管） 2.菌种：白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌 3.方法： （1）取无菌小试管两支，各加入0.2ml小牛血清，分别接种少量真菌，充分震荡混匀，置37℃孵育； （2）每隔1h用接种环取出含菌血清置于载玻片上，加盖玻片，用低倍镜和高倍镜观察，共检查3次。 （3）试验时应设立阳性对照和阴性对照 4.实验结果：