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5-1 实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别 一. 目的 1．掌握配制培养基和制备无菌水的方法。 2. 学会玻璃器皿的干热灭菌和培养基高压蒸汽灭菌技术。 3. 学习倒平板的方法和两种分离微生物的基本操作技术。 4. 学习微生物分离、培养、初步鉴别及菌落的观察。 二. 实验器材 1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。 2.牛皮纸等包扎材料。 3. 10% HCl、10% NaOH、精密pH试纸。 4.牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、 NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O、KH2PO4、1%孟加拉红、10%苯酚、链霉素、琼脂/结晶紫染液等。 5. 高压蒸汽灭菌锅等。 6. 活性污泥。 7．接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱)等。 8．显微镜、载玻片。 5-2 三. 实验内容 （一）培养基的制备及灭菌 1. 玻璃器皿的包扎与灭菌 （1） 六套培养皿一组, 用报纸包装。 （2） 取四支吸量管，用长报纸条包扎。 （3） 干热灭菌:上述玻璃器皿在160°C烘箱内2小时。 2.无菌水的制备 在3支试管中各装入9ml自来水，塞上硅胶塞, 同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。 5-3 3. 培养基的制备（选一种） 牛肉膏蛋白胨培养基配方： 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂 自来水 pH 0.75g 2.0g 1.0g 4.0g 200ml 7.4~7.5 高氏1号培养基配方： 可溶性淀粉 NaCl KNO3 K2HPO4 MgSO4 FeSO4 琼脂 水 pH 4g 0.1g 0.2g 0.1g 0.1g 0.002g 3~4g 200ml 7.4 马丁氏培养基的配方： KH2PO4 MgSO4 蛋白胨 葡萄糖 1/3000孟加拉红 琼脂 水 pH 0.2g 0.1g 1g 2g 20ml 3~4g 160ml 自然 [1]配制溶液 ： 按培养基的配方，称取各种原料。将上述各物依次加入烧杯（高氏1号培养基先将淀粉用一个小烧杯调成糊状，再加入所需水量的沸水中，加热使淀粉完全溶化，再将其它成分依次溶化 ），在电炉上加热溶解时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。注意补充水。 [2] 调pH值： 溶液稍冷后用pH试纸、10% NaOH或10%HCl 调整溶液 pH。 [3] 分装：试管4支各装其高度1/5的溶液，其余溶液装锥形瓶。 [4] 加塞包扎 ：锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。 [5] 湿热灭菌 ： （高压蒸汽灭菌）1.05kg/cm2(103kPa)、 121℃灭菌 20min。 [6] 搁置斜面： 试管培养基冷至50℃时斜搁使斜面长度不`超过试管一半。 6-1 （二）微生物的分离、培养及形态观察 1. 平板划线分离法 (1) 倒平板: 将融化并冷至50℃的细菌培养基（向高氏1号培养基中加入10%的苯酚几滴；向马丁氏培养基中加入0.03%链霉素溶液20毫升）倒约15~20ml于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之均匀。冷后成平板。（3个） (2) 划线：在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取一环菌液（原污泥）在平板上划线。常用的方法有如下三种： 划线完毕后盖上皿盖，平板 倒置于37℃恒温箱中培养1~2天 （高氏1号和马丁氏培养基于 28℃恒温箱内培养3~5天）后观察结果。 6-2 2.稀释平板分离法 (1) 取样 … (2) 稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管和无菌水将10-3倍的水样稀释至10-4、10-5、10-6倍。 (3) 平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓度的水样各吸0.5ml 于相应的培养皿中。加热融化培养基，待其冷至约45℃时以无菌操作倾注10~15ml 入培 养皿中，马上将培养皿平 放桌上 轻轻转 动使之混合均匀， 冷却后 成平板。 倒置，于 37℃培 养1-2天（高氏1号和 马丁氏培养基于 28℃培养3~5天） 后观察结果。 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 6-4 3．菌落形态特征的观察 观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、透明度、气味及粘滞性等。 4．微生物个体形态观察 选定2个菌落。分别涂片，干燥后固定，用结