常用酵母菌表达系统.pptVIP

第十四章 酵母基因工程 酵母应用广泛： 酿酒； 酿醋； 生产酱； 制作面包 培养基成分 基因工程载体 本章内容 酵母基因工程的发展现状 酵母基因克隆载体系统 酵母基因的表达系统 利用酵母基因工程生产乙肝疫苗 酵母基因工程的发展现状 酵母菌的分类学特征 酵母菌基因组特征 酵母菌表达外源基因的优势 酵母基因工程的发展趋势 酵母基因工程的发展现状 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。 酵母菌基因组特征 1989 年1 月-1996 年1 月，酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae) ，最早的真核生物全基因组测序。 16 条染色体，12052 kb，6135 ORF 。 基因组结构紧密，开放阅读框(ORF s) 占据整个基因组的72% 酵母菌表达外源基因的优势 生长迅速，约2小时增殖一代，酵母既能以单倍体形式存在，又能以二倍体形式存在，便于进行遗传分析。 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统。 酵母菌表达外源基因的优势 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定是安全的 酵母基因组小，是最简单的真核模式生物 酵母基因工程的发展趋势 酵母基因工程还存在许多待完善的地方 向人类基因组计划中的应用研究发展 利用酵母基因工程筛选更多的新药 改造酿酒酵母，降低生产酒精的成本 研究酵母的生理承受极限 酵母载体中的调控序列 ARS (auto replication sequence) 2?m质粒DNA 酵母着丝粒(centromere, CEN) 酵母的端粒(telomere) 大肠杆菌基因序列 筛选标记:抗性标记、遗传标记 酵母基因的克隆载体系统 YIp质粒（Yeast integrating plasmid) 整合型质粒 YEp质粒（Yeast episomal plasmid) 附加体型质粒 YRp质粒（Yeast replicating plasmid) 复制型质粒 YCp/CEN质粒（Yeast centiometic plasmid) 着丝粒型质粒 YLP质粒（Yeast linear plasmid） 线型质粒 YAC（Yeast artificial chromosome) 酵母人工染色体 酵母菌的表达系统 酵母表达系统的遗传标记 酵母表达载体系统的特点 载体的基本构架-穿梭载体 原核部分：大肠杆菌复制的起点序列（ori）、抗性基因序列，如Ampr,Kan等。 酵母部分: 2?m质粒DNA；ARS(auto replication sequence)；整合型载体的整合介到区；筛选子（营养缺陷型；抗生素型）；启动子；终止子 信号肽：酵母自身信号肽；异源信号肽 酵母表达载体系统的特点 载体的复制形式 附加型： 如2?m质粒DNA；转化效率高，复制拷贝数高，但容易丢失。 整合型：不含酵母DNA复制起始区，而含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体同源重组，稳定性好，但复制拷贝数低。 酵母表达载体系统的特点 宿主的要求 安全无毒、不致病 遗传背景清楚、容易进行遗传操作 构建的载体DNA容易进入，转化频率高 发酵周期短，培养条件简单，容易高密度发酵 蛋白质分泌能力好 有类似高等真核生物蛋白质翻译后的修饰功能 酵母表达载体系统的特点 酵母的DNA转化方法 原生质体法：早期转化方法，现在已不用 离子溶液法：用各种离子（如Cs+、Li+）溶液进行处理，然后进行DNA转化 一步法：在离子溶液基础上，实用于静止期酵母细胞的转化 PEG1000法：PEG处理酵母细胞获得感受态 电穿孔法和粒子轰击法：转化效率高，仪器昂贵 酿酒酵母附加型表达载体 PGAL1: 半乳糖诱导型启动子；S:分泌信号；CYC1 TT:终止子；URA3:尿嘧啶合成途径中乳清酸核苷5′磷酸脱羧酶基因；2μori:酵母2μm质粒的复制区；ampr:氨苄青霉素抗性基因；pUC ori:大肠杆菌pUC18质粒的复制区；f1ori:f1噬菌体的复制区；kanr:卡那霉素抗性基因 2. 整合型载体 缺乏2μm复制质粒，其它均与附加体型质粒相同 特点:载体的稳定性高，拷贝数低 利用重组酵母生产乙肝疫苗 利用重组酵母生产乙肝疫苗 酵母基因工程的发展现状 酵母基因工程的发展现状 酵母基因工程的发展现状 如果说大肠杆菌是外源