细胞加药处理收集提取RNA到定量PCR过程.docVIP

一、细胞铺板 1、6孔细胞培养板铺入细胞，0.4X106个/孔。 2、铺板第二天加药处理。 3、到达药物处理时间TRI收获细胞，提取细胞总RNA. 二、TRI收细胞 1、小心吸弃培养板孔内的细胞培养液。 2、每孔轻轻加入1ml PBS缓冲液，轻轻摇动培养板3-5次，吸弃PBS缓冲液。 3、每孔加入500 ul TRI，轻轻摇动培养板3-5次，可看到细胞如果冻样溶解，轻轻吹打20-30次至完全成液体样。 4、完全吸取每孔TRI液体，转入已高压灭菌的EP管内，并做好标记。 5、室温放置5min，经行逆转录或转入-30℃保存。 三、TRI提取RNA 1、500ul 溶有细胞的TRI 加入100ul CCL4，用力震摇15s，室温放置2-15min（3min），12000g/min，4℃离心15min。（事先打开低温高速离心机经行降温） 2、吸取上清转入新的EP管内，向每管加入250ul异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，12000g/min，4℃离心10min，可见白色沉淀物贴于EP管底。（白色沉淀即为RNA） 4、加入30ul ddH2O溶解所得沉淀。 四、NanoDrop测定RNA浓度 1、确定NanoDrop2000为通电状态，双击打开桌面NanoDrop2000图标。 2、选择Nucleic Acid。 3、会出现问你谁否打开上次数据窗口，选择NO。 4、然后点击OK继续 5、之后会进入主界面 6、此时软件左上角“Measure”为灰色，打开NanoDrop2000，小心滴加2ul ddH2O盖上，然后打开擦拭一次，再次滴加2ulddH2O。盖上仪器右上角“Type”选择RNA，点击左上角“Blank”。 7、仪器校准结束之后，“Measure”键变为绿色，表示此时可以进行RNA浓度测定。 8、打开仪器盖子，擦去校准用的ddH2O ，小心滴加2ul待测标本，在右上角“Sample ID”内输入待测标本编号，点击“Measure”即可测得待测RNA浓度。 9、实验结束后，小心滴加2ul ddH2O，擦拭干净后关机。 五、RNA逆转录（invitrogen） 1、将下列组分加入无核酸的0.6mlEP管。 Oligo(dT) 1ul RNA 1ug dnTP 1ul 补加ddH2O至13ul。65℃加热5min ，4℃降温3min拿出来。 2、然后向管中加入下列组分： 5X第一链缓冲液 4ul 0.1MDTT 2ul 轻轻混合各组分，37℃孵育2min，4℃降温3min拿出来。 3、向管内加入1ul M-MLV逆转录酶，轻轻吹打，37℃孵育5min，70℃加热15min以终止反应。 注：操作应在冰盒上进行，RNA从冰箱取出时应放在冰上。 六、逆转录的cDNA定量PCR 1、逆转录的CDNA（20ul）加入180ul ddH2O经行1:10稀释。 2、PCR反应体系（TIANGEN）： Sybr 10ul 引物F 0.16ul 引物R 0.16ul ROX 0.4ul ddH2O 4.28ul 总体积 15ul 再加入5ul已稀释的CDNA，总体积为20ul反应体系。