实验SDSPAGE蛋白电泳重点剖析.pptVIP

蛋白质的分离 聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳法 一、实验目的 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术 二. 基本原理 (一) 电泳 电泳: 带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动的现象. (二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 用丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合成的多孔介质.以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。 1 凝胶聚合催化体系 化学催化：AP-TEMED 催化体系 Bis将单体长链间连成网状结构 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响： ? 催化剂和加速剂的浓度 ? pH 碱性条件 ? 温度 ? 分子氧 ? 杂质 2. 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性 (1) 凝胶有弹性，机械性能好；几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好； (2)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度较高。 (3)凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (4)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系 3. 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 4.聚丙烯酰胺凝胶种类 (1) 连续系统与不连续系统两大类 不连续系统:是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。 (2)不连续体系:电极缓冲液、浓缩胶及分离胶 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH 6.7的Tris-HC1。 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH 8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 三. 实验器材 1、电泳仪,电泳槽及其附件 2、培养皿 3、摇床 4、烧杯 5、移液管 6、微量进样器 7、针管 电 泳 装 置 电泳仪： 提供直流电在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移 垂直平板电泳槽 每组（3人）做一板胶，前后可安置两副板，两组共用一套电泳装置。 四. 实验试剂 BSA； 分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液 pH8.9； 浓缩胶缓冲液: Tris-HCl缓冲液 pH6.7； 分离胶贮液:Acr 28.0g,Bis 0.735g,无离子水溶解定容至100ml； 浓缩胶贮液: Acr10.0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至100ml； 过硫酸铵溶液（AP） 电泳缓冲液: Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3； 10%SDS 固定染色液 脱色液 (一) 垂直平板电泳槽的安装 (二) 凝胶的制备 (三) 加样 (四) 电泳 (五) 固定和染色 (六) 脱色 五. 操作步骤 五. 操作步骤 (一). 垂直平板电泳槽的安装 注意短玻璃板是向内侧的。 要将玻板底边平齐地压紧在红色橡胶条上，否则容易漏胶。 (二). 凝胶的制备 1 分离胶的制备 (7%) 配8 mL (按如下顺序加入） 分离胶缓冲液 1 mL 分离胶贮液 2 mL 去离子水 4.7 mL 10%SDS 0.08mL TEMED 10 uL 过硫酸胺（AP) 0.20 mL 将上述试剂迅速混匀后，用滴管沿壁迅速加样至3/4处，再取大约3 mL的水加在上面直至凝胶凝固为止。 加入AP后请迅速混匀加样，否则易凝固无法加样 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 水封的目的是为了使分离胶上缘平直，并排除气泡 2.凝聚后倒出上层的高纯水，可用滤纸在边缘吸水。 3.浓缩胶的制备 (2.5%) 配 4