实验二植物总RNA的提取重点剖析.ppt

* * 实验二、植物总RNA的提取 一、实验目的： 1.了解真核生物基因组RNA提取的一般原理。 2.掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。 3.了解RNA纯度的检测。 二、一般原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。 Trizol试剂配制 苯酚饱和液（38%）-380ml/L 硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g） 硫氰酸铵（0.4M）-- 76.12g 醋酸钠pH 5（0.1M）- 33.4ml 甘油 – 50ml 加水至1L 。 三、材料 植物组织 四、设备  移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，1.5ml离心管。 　　 　　 　　 五、试剂 　　1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 　　2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 　　3、氯仿:异戊醇 [24 : 1 （v/v)] 、氯仿。　　4、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇。 5、Trizol试剂。 六、操作步骤 1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube分装0.1克样品； ２.　每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 ３、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离 ４ 、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置3分钟 ５、 10000r/min离心5分钟 ６、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置3分钟，10000r/min离心5分钟。  ７、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4℃下10000r/min离心5分钟。　　 ８、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于20微升TE或DEPC处理过的水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。 RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃ 七、检测 1、DNA的紫外分光光度计检测 OD260/OD2801.8 1OD260=40 μg/mL DNA 2、甲醛变性琼脂糖电泳检测 八、注意事项 （1）Trizol、DEPC等有毒，与皮肤接触会引起伤害。操作过程带手套，在通风条件下操作。 （2）避免带入RNase进入样品 带手套，别用手碰任何与样品接触的物品。 使用新的已灭活RNase的塑料器皿与用具。 （3）爱护仪器设备,安全操作 作业： 1、RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？ 2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。 补充： ＤＮＡ检测方法 １.　此外分光光度计检测 ＯＤ２６０值＝１时，相当于含５０μg/mL DNA ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１.８～１.９时，DNA较纯 小于１.８时，蛋白含量较高，大于２.０则含有ＲＮＡ或有断裂ＤＮＡ １.　琼脂糖电泳检测 *