实验一蛋白质的定量测定课程介绍.ppt

取2支试管，各加入一定量的血清稀释液(已经稀释100倍，其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内)，本实验取0.2ml血清稀释液，再加入0.8ml蒸馏水使样品体积达到lml。其他操作与“标准曲线的制作”相同。 2.血清蛋白质浓度的测定 反应物 (ml) 0（空白对照管） 1 2 血清稀释液 (已经稀释100倍) 0 0.2 0.2 蒸馏水 ml 1.0 0.8 0.8 Folin-酚甲ml 5.0 5.0 5.0 Folin-酚乙ml 0.5 0.5 0.5 A (640nm) 蛋白质浓度 (mg/L) 0 混匀后30度水浴锅中放置10 min 取3支试管 加Folin乙后立即摇匀，30分钟后以0号试管为空白对照，在640nm处比色 3、数据处理 1、绘制标准曲线：以A500为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上或用EXCEL绘制标准曲线。 2、计算特测蛋白浓度：用待测蛋白质的A500从标准曲线上查出其对应的蛋白含量，据实验中所加入的待测蛋白质的体积计算其浓度。 100 10 100 / (g) -6 640 ＊ ＊ ＝ 血清稀释倍数 数 测定时用稀释血清的 含量 值对应标准曲线蛋白质 血清 蛋白质 ml A ml 722分光光度计： 1.开电源预热20分钟 2.调波长 3.用黑体调T值(透光率）为0% 4.用对照管的溶液调A值（吸光率）为0%。 5.测各浓度的标准蛋白质和血清蛋白质的A值。 1.酚法进行蛋白定量测定的优缺点。 2.常用的蛋白质含量测定方法在哪些？ 【思 考 题】 实验一 蛋白质的定量测定——Folin-酚试剂法(Lowry法) 实验室规则 一、学生必须服从老师的指导，按照实验目的、要求和方法做好充分准备，进行实验。 二、保持实验室内安静、整洁，有秩序地进行工作。 三、按照操作规程(规则)进行实验，正确地据实将实验数据等情况填写在规定的记录本上。 四、节约实验材料和水电，按规定的数量取用原料和试剂。 五、爱护仪器设备，实验完毕时，负责清洗干净，并按规定要求存放原处；仪器设备如有损坏，应立即报告老师，同时向管理人员说明情况，按规定办好报损或赔偿手续。 六、实验室内严禁吸烟，不准带入食品，不准会客。 七、不遵守实验室规则的应给予批评教育；对于严重违反操作规程并造成重大损失者，除赔偿损失外，并视情节轻重给予必要的纪律处分，直至追究法律责任。 实验报告的书写 实验报告是对实验结果的科学总结。书写实验报告是培养和提高文字表达能力 及概括综合分析问题能力的重要训练方法。每次实验后要求写好实验报告。实验报告的书写要求结构完整、条理分明、文字简炼、书写工整、措词推理符合科学性、逻辑性。具体格式如下： 1．实验名称 姓名 学号 班级 2．目的要求 3. 原理 4. 主要试剂和仪器 5．操作方法： 6．实验结果：是实验报告的重要部分，一般要列出经过归纳整理的结果，并将实验数据列表说明，若为图形资料，应做好标记及剪贴。 7．讨论：要针对实验中所观察到的现象与结果而言，注意不要离开实验的实际去空谈理论或照抄书本。要判断结果是否为预期的，属于非预期的，要认真分析原因。 1学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。 2制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。 一目的要求 二 原 理、 1. 凯氏微量定氮法 2. 紫外分光光度法 3. 双缩脲法 4. Folin—酚试剂法(Lowry法) 微量凯氏定氮法 含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。此过程通常称为“消化”。强碱使硫酸铵分解游离出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此过量酸液中和的程度，计算样品的含氮量。 本法适用范围0.2-1.0mg氮，相对误差应小于2%。 紫外分光光度法 蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。紫外吸收法在蛋白质含量20-100μg/ml内服从比尔定律。 双 缩 脲 法 在碱性条件下,具有两个以上肽键的物质能与双缩脲试剂的铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），颜色深浅与肽键的多少即蛋白质含量成正比。 由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。 通常可用此法来定性鉴定蛋白质的存在。 也可根据反应生成颜色的深浅，在540nm波长处进行比色，定量测定蛋白质的浓度。 允许测定范围为1～10 mg蛋白质。 除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、