实验一细菌的革兰氏染色课程介绍.ppt

实验一 显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色 一 实验目的 1 学习显微镜油镜的使用方法 2 学习微生物的无菌操作技术 3 学习细菌的革兰氏染色法 二 实验原理 1 显微镜及油镜物镜的使用原理 1) 油镜头的标志 油镜头上常刻有OI（oil immersion）或 HI（homogeous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短。 2 ) 显微镜的分辨率 显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它的分辨率的大小。分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比： D=λ/2NA 从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。 数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积： NA=n×Sinα/2 影响数值孔径大小的因素－是镜口角，二倍介质的折射率。 当物镜与玻片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.0）与玻璃（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃的相近，光线经过玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。 介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较 2 细菌的革兰氏染色原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类. G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三 实验器材 1 菌种：培养24h的枯草杆菌（ Bacillcus subtilis） 、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。 2 染色液和试剂： 生理盐水、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液, 香柏油，显微镜擦拭液. ３器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。 四 实验方法 1 涂片: 取一干净载玻片,中央滴一小滴生理盐水,无菌操作取菌 无菌操作(快):在酒精灯上灼烧接种环(注意手势)---松动试管帽---取下试管帽---灼烧管口---在火焰旁接种环通过火焰进入菌种管---接种环在管壁冷却---挑取菌少许---退出---灼烧管口---盖帽---涂片(调匀涂成薄膜)---灼烧接种环. 2 干燥: 室温自然凉干 3 固定: 见课本10页. 4 结晶紫染色: 见课本10页. 5 水洗:见课本10页 6 媒染:见课本10页 7 水洗:见课本10页 8 脱色:见课本10页 9 复染:见课本10页 10 水洗:见课本10页 11 干燥:室温凉干或吹风机吹干 12 镜检:先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，油观察细菌的形态。 五 实验结果 课本11页五 六 思考题 １　课本第11页七第1题. ２　课本第11页七第2题. 3 课本第11页七第3题. 4 课本第11页七第4题. 5 用油镜观察时玻片为什么要完全凉干? 6 革兰氏染色成败的关键是什么? 7 叙述无菌操作时应注意的问题． * *