PCR质量控制.ppt

临床基因扩增检验质量要求   制定依据 《医疗机构临床实验室管理办法》（卫医发[2006]73号） 《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]194号） 医学实验室质量和能力认可准则 ISO15189(CNAS-CL02) 医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明（CNAS-CL36） 医学实验室质量和能力认可准则在病理学检查领域的应用说明（CNAS-CL37） 临床基因扩增检验质量控制 分析前—患者准备、标本（采集、运送、验收、保存）、医生报告单申请 分析中—样本分样、仪器、检测过程、结果的有效性判断 分析后—检测报告、报告传递、结果的接收、结果解释 标本 标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本的类型和采集量 采样及运输容器 采样质量的评价 标本采集中的防污染 标本采集时间 1、血清（浆）：无特殊要求 2、如用泌尿生殖道分泌物做CT、NG项目：应在抗生素应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗生素，应于下次抗生素应用前采集。 3、如用痰做TB：应在抗结核药物应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗结核药物，应于下次抗结核药物应用前采集。 因为PCR方法所检测的靶物质为核酸，不受标本生物活性的限制，对于已经死亡的病原体仍可检测出来，即感染后在药物治疗有效的情况下，患处仍会有少量已死亡的病原体存在。 标本采集量 标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。 采样容器 采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是 Taq酶的强抑制剂，且在核酸提取过程中很难完全去除。 使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌，以使可能存在的RNase永久性失活。 标本验收、拒收 血液标本：溶血、严重脂血等应拒收 泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。 痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般10个，白细胞一般25个。 标本拒收原因分析，采取有效措施予以纠正 标本运送 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件（温度、时间）作出相应规定。 靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，建议采集后8h之内送至实验室； 靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验室； 所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至实验室前，均应放2－8℃临时保存。 淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。 标本保存 靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融） 靶核酸为DNA的标本2-8℃保存1-3天，靶核酸为RNA的标本应－20℃下保存 －20℃下保存1个月 －70℃以下可长期保存 如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10TE缓冲液{mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5～8.0)}2-8℃下保存。 用于RNA扩增分析的样本，则应于上述 TE缓冲液中-70℃保存。 标本接收 标本接收建议在三个测定区之外 接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性 标本处理 血清（浆）： 应1小时内分离血清，抗凝后4小时内分离血浆，然后转移至1.5ml灭菌离心管中保存。若血清分离不充分，可1500rpm离心5min 。 如甘油三酯含量超过6mmol/L或肉眼可见血清/血浆呈白色浑浊状的标本，应4℃13 000rpm离心15min,吸取下层清亮血清或血浆转移至1.5ml灭菌离心管中保存 泌尿生殖道分泌物 一次性采样管（含保养液） 配套棉拭子（不含保养液） 痰液 结核分枝杆菌DNA检测标本：用4%NaOH摇匀，室温下放置30分钟左右液化，转移至1.5ml灭菌离心管，离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化时不能加热，液化时间不能过长。 非结核分枝杆菌DNA检测标本：痰标本在室温悬浮于灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块黏状物下沉，取上清离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切记不能用NaOH液化痰标本。 实验室仪器设备 分册建立仪器档案 仪器卡、仪器运行状态标识 定期维护保养 定期校准/检定 相同检测项目在不同的仪器或系统上进行检测时，应做比对 （2次/年，每次至少20份标本，计算回归方程，系统误差应7.5%） 当设备出现故障时 ： 1）应立即停止使用，并加上明显标识