土壤中具抗肿瘤活性微生物的筛选与分离.doc

土壤中具抗肿瘤活性微生物的筛选与分离 湖南师范大学生命科学学院2012级基地2班肖蓉 摘要：随着癌症发病率的日益增高，如何快速有效地找到癌症的治疗方法迫在眉睫。通过微生物发酵技术生产抗肿瘤活性物是一种简单易行的方法。土壤中放线菌种类与数量位居第二，在这之中有许多具有抗肿瘤活性的类别仍待被发现，因此，通过在土壤中筛选具有这种特性的菌株具有必要性。 关键词：放线菌 抗肿瘤 鉴定与筛选 目录 （一）土样采集 （二）富集 （三）分离培养 （四）筛选 （五）产物分析 （六）文献引用 （一）土样采集 土壤是环境微生物学研究中最具挑战性的环境,配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到100ml，调pH。高温灭菌后，倒平皿前加入10%酚2滴至100ml培养基中混匀，将培养基倒入平皿内约15ml/皿⑴初筛 初筛是指从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物能力的微生物筛选出来的过程。一般采用平板筛选和摇瓶筛选的办法，高通量筛选技术的兴起使得筛选过程自动化，更快速、便捷。由于先前在分离培养过程中菌落已经进行过多次纯化，所以接下来就是进行摇瓶发酵的筛选。配置高氏一号的液体培养基，分装成几瓶，40ml/250ml锥形瓶，调好pH值后灭菌，冷却后接入已经纯化好的单菌落的菌株，放入摇床，270rpm、32摄氏度进行摇瓶发酵，5天后菌液出现浑浊或者小球状的菌落团，无菌条件下取出适量的菌液进行相差显微镜的镜检，观察菌落生长状况以及是否染菌，一般在此时菌落进入对数期生长，对于生长状况好、未染菌的菌株可以制成菌保液放入-80摄氏度冰箱保存以备今后使用。在发酵第八天左右，菌落进入稳定期生长，此时，是各种发酵产物含量最多的时期，也是收获产物的最佳时期。停止发酵，取出菌液，分装到小的EP管中，作为实验用。每种菌分装3-4支。 发酵完成后，就可以进行初筛了。将用于试验的肿瘤细胞复苏解冻后传代培养，接下来就可以对生长状况良好的肿瘤细胞进行实验。将肿瘤细胞铺板后，加入菌种发酵液做初筛，初筛要求对生物活性检测既快速又准确，为特异性药理活性物质提供一个有效的筛选方式。体外初筛最常用的模型为小鼠体内的L1210和P338淋巴细胞，最小火性标准为50%延滞存活。每个菌株只做1至2块板的生测实验，记录结果比较好的菌种，做好标记并记录肿瘤细胞的对应实验结果。每个菌种选取几种不同的肿瘤细胞做生测实验，然后综合分析菌种的抗肿瘤效果，对该菌种做出一个初步评估 ⑵复筛 通过初筛工作，一般可以淘汰85%-90%不合要求的微生物。余下的菌株继续进行摇瓶培养，步骤与初筛同，然后取菌液做更加精细的细胞生测实验。此次每个菌株做2-3次重复实验，且用于试验的肿瘤细胞株种类应更多。对于此次结果好的菌株，可以再做一个菌液的浓度梯度的实验，以探索不同浓度下菌株发酵产物的抗肿瘤活性的强弱。经过这一系列的筛选工作，具有较好的抗肿瘤活性的菌株就已经基本上分离出来了，当然，除了单独培养外，也可以做不同菌株之间相互混合培养对其活性的影响。由于复筛的重复试验组数多，工作量很大，因此，也可以结合一些高通量筛选的方法，比如一些机械自动化仪器的使用与检测仪器的结合使用。 （五）产物分析 进行复筛后，对于抗肿瘤活性表现好的菌株，就要对其抗肿瘤活性物进行产物分析。用于检测多种抗肿瘤实际的指纹法，省去了对已知抗生素的频繁的重复检测，提高了对抗肿瘤活性物的筛选的工作效率。主要是避免了用在已知的抗肿瘤活性物的分离上的体力和时间。指纹法包括：抗微生物活性、纸层析、菌种鉴定、薄层层析、紫外吸收光谱、高效液相色谱。以下选取几个方法进行试验。 1，抗微生物活性：通常用于抗微生物活性分析的菌株有鼠伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等致病菌，对他们做一个抑菌实验分析，可以初步得出待测菌株的抗菌活性。这一版还可以通过分离培养过程中透明抑菌圈的大小初步判断待测菌株的抑菌能力。试验中，把待检菌株菌液制成浓度梯度，然后通过滤纸片接种在上述几种致病菌的生长平板上，然后测量和记录抑菌圈的大小。 2，菌种鉴定：将待检菌株进行预处理，即将菌种从培养基中分离出来。通常是离心分离、溶菌酶处理破壁、蒸馏水洗、再离心等步骤，得到菌株。然后通过16srRNA分析，包括pcr扩增、热转、连接等步骤后送去专门测序的公司如Life Tech、上海生工，测序后在NCBI官方网站进行BLAST比对，得到近似菌及G+C的%值，最后构建系统发育树，对筛选出的有抗肿瘤活性的菌种进行一个分类。 （六）文献引用 1，海