猪超低温冷冻保存技术研究.docx

猪精液冷冻保存技术研究进展 摘要：随着人工授精技术（AI）在实际生产中的广泛应用，猪精液冷冻保存技术也逐渐发展起来. 此项技术解决了精液长期保存的问题，使精液的应用不受时间和空间的限制，便于开展跨区域、跨国家的种质资源的交流协作，延长了优良种公猪的利用年限，从而大大提高了其利用率，对品种的改良、血统的更新以及育种成本的降低等方面意义重大.本文主要对猪精液冷冻的研究简史进行描述，并总结了目前猪精液冷冻过程中冷冻保护剂的添加以及冷冻解冻后的精液品质的检测，从而对今后的实验设计与操作，生产技术等起到一定的指导作用。 关键词：猪精液，冷冻保存，冷冻保护剂，精液质量检测 精液冷冻保存技术的原理是利用液氮（1%℃)、干冰〔79℃)或其它冷源，将精液经过适当的处理，使精子细胞的代谢完全停止，在升温后可恢复原来部分活性，从而达到长期保存的目的。使用时再解冻进行人工授精(Atiificial insemination，Al)或体外授精(In vitro fertillzation，IVF)。精液冷冻可大大提高种公畜的利用率，减少公畜的饲养量，节约成本且不再受地域、时间的限制。不仅有利于家畜品种改良，也是家畜育种和珍惜濒危物种保护的有效技术手段。总之，精液的冷冻保存对人类生殖医学、家畜繁殖育种及保护濒危野生动物等方面都有重要意义[1,2]。 1 猪精液冷冻保存研究简史 Polge等首先发现甘油对牛精子具有冷冻保护作用[3]，依据此原理，Polge在1950-1960年间将牛精液冷冻方法用于猪精液冷冻保存，解冻后的猪精子具有活力，但没有受精能力[4]，1970年，他又向母猪输卵管中直接注入冷冻解冻后的猪精子，并最终获得仔猪[5]。随后Pursel and Johnson通过试验证实猪精子在冷冻解冻后仍然具有一定的受精能力[6]。 猪颗粒和细管冷冻精液自1975年开始在商业中得到应用[7]，但猪精子自身具有其特殊性，它对降温非常敏感，冷冻解冻后异常精子数较多、精子活力及受胎率较低，鉴于以上原因，目前猪冷冻精液在实际生产中并未得到广泛应用，现仍以鲜精或液态保存精液为主，冻精用于猪人工授精的使用率不足1%。猪冷冻精液一般用于省际或国际间的品种改良[8]。从1985年至今，学术界已经召开了五次关于猪精液冷冻保存的国际性会议，极大的推动了猪精液冷冻保存技术的发展。直到今天，颗粒和细管冻精或其它改进过的冷冻剂型仍在普遍使用，但由于繁殖成绩不理想，猪冷冻精液未得到大范围推广。Almlid and Hofmo[9]用解冻后精液和液态保存精液进行对比试验，结果证实前者输精后的母猪较后者的产仔率低20%～30%；而窝产仔数则少2～3头。Eriksson 等[10]用5 ml扁平细管制作猪冷冻精液并出口，解冻后精子活力为49%～53%，质膜完整率平均为60%，产仔率达到73%，平均窝产仔数达10.7头。 我国于1954年在广西率先开展了人工授精试验，后经过反复实践和改进，此技术得到了一定的推广和应用。1975年，西北农学院与西安草滩农场将解冻后精液试配了8头母猪，有4头产仔，平均窝产仔数为8.9头，取得突破性进展[11]。后来在一些省市相继获得成功，人工授精技术得到了广泛的推广和应用，并取得了一定的成绩。 2 猪精液冷冻过程中的冷冻保护剂添加 2.1卵黄 Phillips 等[12]通过试验证实卵黄在精液冷冻保存中可以起到较好的抗冻作用，卵黄能附着于精子表面，对精子质膜和顶体均有较好的保护作用。而卵黄起保护作用的有效成分是低密度脂蛋白（LDL），其作用机理可能是卵黄LDL中的磷脂进入精子质膜和顶体外膜中，使膜的稳定性增强，进而对精子进行保护。卵黄一般添加量为20％。目前稀释液中添加的卵黄一般为鸡蛋卵黄，研究者已经尝试用其他禽类卵黄代替鸡蛋卵黄用于猪精液冷冻保存。Bathgate 等[13]研究了用鸭蛋和鹌鹑蛋卵黄替代鸡蛋卵黄用于猪精液冷冻保存，解冻后对精子质量进行评估，结果表明，鸡蛋卵黄组在刚解冻时具有较高的精子活率，而解冻后37℃培养3～6小时的结果显示不同卵黄之间对冻后精子活率没有显著影响。与鹌鹑蛋卵黄组相比，鸡蛋卵黄组和鸭蛋卵黄组在刚解冻时获得了很高的顶体完整率，在培养6小时后，鸡蛋卵黄组的精子顶体完整率下降速度较慢，而鸭蛋卵黄组顶体完整率显著下降。Fraser等[14]将从鸵鸟卵黄中分离出的脂蛋白（LPFo）与乳糖和甘油配制成冷冻稀释液，用于猪精液冷冻保存。检测冻后精子质量，并进行输精试验，受胎率为75%，平均窝产仔数达10.5头。 2. 2渗透性和非渗透性冷冻保护剂 渗透性冷冻保护剂能够穿透细胞膜进入细胞内部，从而使溶液的浓度降低，细胞的渗透性肿胀减轻，通过减缓细胞皱缩和减少冰晶形成最终达到保护精子的目的。如甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、DMF和DMA等。非