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实验一　细胞内碱性蛋白的显示 —— 组蛋白的显示 一 、实验目的 掌握细胞内碱性蛋白的鉴别方法并了解碱性 蛋白在细胞内的分布。 学会制作血涂片并掌握制作技巧。 二、实验原理 由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。 三、实验用品 1．材料 鲫鱼 2．试剂 1)carnoy固定液(无水乙醇：氯仿：冰醋酸按6：3：1配制) 　一次要配制1L. 2)0.1%碱性坚牢绿染液：取0.1 g坚牢绿加入100毫升蒸馏 　水，再加少量0.1M NaoH 调节pH至8.0-8.1. 3)5% 三氯醋酸 4)70%乙醇 5)香柏油 3．器材 解剖盘，注射器，载玻片，显微镜,水浴锅等。 四、实验方法 1．将鲫鱼放入盘中，尾静脉取血,滴一滴血在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。 2. 将涂片作好标记放在现配制的Carnoy固定液中固定10分钟，室温晾干。 3．放入现配制的5％三氯醋酸中90℃(10-15分钟)，抽提出核酸。 4. 将玻片放在70%乙醇中5-10分钟．清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。 5．滤纸吸干玻片上水分。 6. 一张片放入0.1％碱性固绿(pH8.0～8.1)中染色15～20分钟。 7．清水冲洗（3分钟），盖上盖片镜检。 对照片 不进入5％三氯醋酸中抽提出核酸。其他步骤同上。. 五、实验中注意事项 (1)用5%TCA提取DNA是该实验中的关键。 DNA必须被提取，以使染色质的负电荷下降，用热TCA提取核酸后，酸性染料（固绿）在碱性pH下，碱性蛋白可以选择性地被染色，如未被提取，不能染色，或整个切片染成蓝绿色，水洗或进入酒精即褪色。 (2)染液pH必须高（ pH8.0~8.1），从而使其他蛋白质染色极微。 六、血涂片的制作 １.取一滴鲫鱼新鲜的血液，置于玻片的一端，以左手拿该片的两端，迅速用右手拿住另一载玻片的一端，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成４５°角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片。 ２.室温下自然晾干。待晾干后进入到Ｃａｒｎｏｙ固定液中进行固定。 注意：在制作血涂片的过程中要用力均匀，避免来回推拉及刮片．好的血涂片在显微镜下观察到的细胞应成单层均匀排列。 七、相关理论知识 １．家畜血涂片。低倍镜下观察可见大量圆形而细小的红细胞。白细胞很少，稀疏地散布于红细胞之间，选白细胞较多的部位（一般在血膜边缘和血膜尾部，因体积大的细胞常在此出现）。 红细胞:呈圆盘状,边缘厚,中间薄,无核。 中性粒细胞:是白细胞中较多的一种,体积比红细胞大,核呈杆状(为幼稚型,胞核细长,弯曲盘绕成马蹄形,S形,W形或U形等多种形态)或分叶状,一般分3~5叶或更多，跟该细胞年龄有关。 淋巴细胞：有大中小三种类型，其中小淋巴细胞最多，血膜上很易看到，体积与红细胞相近．具核，核大而圆．大淋巴细胞在正常细胞中不常见到，体积与单核细胞相近或略小，胞核圆形，胞质较小淋巴细胞多。 八、实验结果 经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色,细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。 九、思考题 1.细胞内碱性蛋白显示的基本原理? 2.制作一张好的血涂片应掌握什么技巧? 3.家禽,家畜及鱼类的血细胞有何区别? 实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位 一、实验目的 1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤。 2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。 二、实验原理 酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，主要存在于巨噬细胞,定位于溶酶体内。正常条件下,巨噬细胞处于休止状态,酶活性很低。但在合适的pH条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现出一系列显著的变化， 如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增强，从而改变其渗透性底物可以渗入,酶活力被显示。 反应如下： β-甘油磷酸钠→β-甘油 +PO4 3- PO43-+Pb(NO3)2→Pb3(PO4)2（） Pb3(PO4)2 +(NH4)2S→PbS () 三、实验材料、试剂和仪器 1.材料 小白鼠 2.试剂 1)甲醛钙固定液：甲醛10ml,10%氯化钙 10ml,蒸馏水80毫升。 2)酸性磷酸酶作用液:称取硝酸铅25mg,加0.05mol/L 乙酸缓冲液22.5ml,搅动使之全部溶解后,再缓慢地 滴加3% β -甘油磷酸钠液2