广西眼镜蛇CT与PLA2基因的真核表达与镇痛活性检测.pdfVIP

广西眼镜蛇口7_和眦基因的真核表达及镇痛活性检测 摘要 药物，在医用研究领域发挥巨大的作用。但由于蛇毒的产量小且分离 难度大，限制了蛇毒在医用上的应用范围。因此，本研究旨在利用昆 虫杆状病毒表达系统在体外获得具有镇痛活性的广西眼镜蛇蛇毒蛋 A2，PLA2)。 分别利用分段克隆和反转录PCR的方法克隆了广西眼镜蛇CT 和P幽2基因的编码序列。然后将携带和不携带His标签的CT和尸以2 0的下游，获 Dual启动子PH和pl 插入杆状病毒穿梭载体pFastBacTM 6种穿梭载体转入DHl0Bac中，用抗生素(庆大霉素、卡那霉素和 四环素)和蓝白斑筛选、PCR和测序鉴定，得到携带目的基因的6 BM-HPLA2、BM-HCT-HPLA2。 利用转染试剂CellfectinII将携带目的基因的6种昆虫病毒表达 载体和空载体转入St9昆虫细胞，经PCR鉴定，成功获得了7种病 毒颗粒。用病毒颗粒感染细胞，经SDS．PAGE电泳检测目的蛋白的 表达，结果显示，在细胞裂解上清中检测到特异目的条带，提示目的 蛋白是可溶的。 分别利用电洗脱和Ni柱亲和纯化的方法成功从细胞裂解上清中 纯化出不携带His标签的目的蛋白CT和PLA2和携带His标签的目 的蛋白HCT和卸凡A2。用小鼠的扭体实验检测其镇痛活性，结果显 示：CT镇痛效果极显著(p，0．05)，并且Ni柱纯化的效果显著好于 电洗脱(砌．05)。HPLA2的镇痛效果不很明显(胗O．05)。 关键词：广西眼镜蛇／蛇毒蛋白／凝脂酶A2／昆虫表达系统／镇痛 I and of AnalysisGuangxi EukaryoticExpressionAnalgesic CobraCTor PLA2 ABS嗽CT neurotoxin inmedicineas Cobra Q盯)hashugetherapeuticpotential anestheticsor ofnaturalneurotoxinisa antidotes．However,production limitedthe of littleanditisdifficulttoisolate．That application sharply neurotoxinin ofcurrentisto medicine．Therefore，the study objective thefunctionalcobra cobortoxin(CT) purify Guangxi express，isolate，and and insect vitro． A2gLA2)inexpressionsystem／n Phospholi