第十章电泳技术讲课.pptVIP

在自由界面电泳中，样品被放置在U型电泳管的缓冲溶液中，然后外加电场。 在几种组分的混合物中，由于不同离子的电量、大小和形状的不同导致它们在缓冲液中的移动速度不同，结果在整个管子中出现了不同的分隔界面。 在一系列的分界范围中，是以组分的浓度变化参差而排列的，这样的浓度梯度可用一个适宜的光学系统进行测量。 通过整个管子的连续量析技术，就可以确定不同界面的位置、数量以及区域的浓度，因此可用来测量电泳迁移率，进行混合组分的分离和分析等。 自由界面电泳由于仪器装置复杂、价格昂贵，因此只限于实验室规模操作。 二．自由溶液中的区域电泳 1．微量电泳 微量电泳是一种基于单个粒子受到电场作用时会移动非常小的距离的事实来测量带电粒子迁移率的高度专业化方法。 电泳迁移率可通过测量一个粒子走过一定距离所需的时间来计算求得。所走的距离可从显微镜目镜的分度尺上读出，可调节元件两端间的电位，使测量时间控制在10秒左右。 2．自由流动电泳 这是一种较大规模的分离带电粒子的方法，与其它电泳方法相比，可溶物质的分辨(例如蛋白质)非常差，它在细胞分离操作上的主要优点是能很好地保持细胞的存活力。 电泳仪有一个分离槽，分离的样品被缓冲溶液围着，在槽的顶端一小口中注入样品，随着样品的移动，不同的成分分离成单个区带按不同的偏斜方向经过分离槽，如果样品不断地从槽的上端泵入，组分沿一系列对角线方向移动，可在另一端不同部位上收集到被分离的组分。 3．密度梯度区域电泳 如果区域电泳是在简单缓冲液中进行的，由于被分离区域的扩散和沉降，会发生分辨率的严重下降，但利用密度梯度电泳时，这两种因素产生的影响会大大降低。 密度梯度区域电泳几乎总是在垂直柱中进行，典型的蔗糖密度梯度从10％～50％左右，密度梯度越陡斜，阻止对流和样品区带重力沉降的稳定能力越大，所以，样品承载能力也越大。 4．葡聚糖凝胶柱上的区域电泳 多数情况下，样品组分被完全排斥在葡聚糖凝胶珠体外，因此按大小分级分离没有发生，样品实质上在珠体外的溶剂相中进行自由溶液电泳，葡聚糖凝胶的作用只是用来阻止对流(由于缓冲液黏度不增加，所以不会减少扩散) 。 三．在不同支持物上的区带电泳 应用支持介质的电泳称为区带电泳，它表示在一个电场的作用下，在某一种支持物上能将一个样品组成彻底分离成若干条区带(组分)的过程。 根据支持介质不同的分类 ① 纸电泳(滤纸、玻璃纤维)； ② 醋酸纤维电泳； ③ 凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉、聚丙烯酰胺等)； ④ 粉末电泳(淀粉、纤维素、葡聚糖凝胶、聚氯乙烯、玻璃等)。 电泳槽的分室中充满着缓冲液，目的是保持pH值在一定范围内，多组分离子性物料样品常置于分室的中心区内。 在一定的电场作用下，所有系统中的离子按恒定的速度迁移，实现分离，其效果取决于实验条件和离子所带电荷的符号和大小。 1．滤纸电泳 以滤纸作为带电质点溶液的支持物来进行的电泳称为(滤)纸电泳。 在化学成分分离鉴定中，纸电泳常常与其他层析方法配合使用以达到预期的效果。它除了用做常规分析方法外，还常用做对物质的带电特性进行试探性摸索。 用醋酸纤维素条带或塑料薄膜做支持物来进行的电泳。 醋酸纤维是由纤维素的羟基经乙酰化而成。将之溶于丙酮等有机溶剂中， 即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约以0.1-0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度而易碎。 目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售。 2．醋酸纤维素电泳 醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点： (1)分离效果好。对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测定的精确性。 (2)快速省时。由于亲水性较滤纸小，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45-60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min左右。 (3)灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μL血清，故常用于检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 (4)应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等用醋酸纤维素薄膜电泳能较好地分离。 (5)易保存，易定量。醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子。 3．琼脂糖凝胶电泳 利用环氧丙烷与中性的琼脂糖进行聚合可得琼脂糖凝胶。 琼脂糖凝胶电泳分辨率高，分离速度极快、机械强度大，加上操作条件方便和装置简单，所以琼脂糖凝胶电泳应用面更广泛。 由于凝胶是透明的，因此可与免疫法技术结合进行免疫