微生物分子生态学研究方法资料.ppt

微生物分子生态学的一些研究方法 分子生态学是应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制的科学。它是生态学与分子生物学相互渗透的形成的一门新兴交叉学科，其研究内容包括种群在分子水平的遗传多样性及遗传结构，生物器官变异的分子机制，生物体内有机大分子对环境因子变化的响应，生物大分子结构、功能演变与环境长期变化的关系以及其他生命层次生态现象的分子机理等。 微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容。 20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。 3、生物标记物法（Biomakers ） 生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。 特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。 首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适的仪器加以定量测定。 磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。 PLFA方法适合跟踪研究微生物群落的动态变化,能够快速有效的从环境样品种提取大部分脂肪酸,但是也有其局限性。 第一,他不能从种的水品上鉴定微生物,只能鉴定到属; 第二,这种方法强烈的依赖于标记脂肪酸,标记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计,因此操作过程需要十分谨慎,防止人为因素的干扰。 第三,细菌和真菌在不同的生长时期以及环境压力下的脂肪酸含量有所变化,给监测带来困难。 另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。 4. ERIC (肠杆菌基因间保守重复序列) -PCR指纹图谱技术 Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。 5. 以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法 实验原理 16S rDNA是基因组的“biomarker” – 核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16S rDNA广泛存在于所有原核生物的基因组中。 – 16S rDNA的序列中包括保守区和可变区。 – 序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应，而且一般不发生水平转移。 – GeneBank和RDPⅡ（Ribosomal DatabaseProject ）数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释的16S rDNA序列，可供进行比对。 环境16S rDNA文库的构建与组成分析技术 1990年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性。 16S rDNA文库中的蓝藻种类与培养出来的蓝藻很不一致； 发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群； 与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生物多样性； 这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。 构建环境16S rDNA文库的方法 用环境基因组总DNA进行16S rDNA PCR扩增：把环境中几乎所有微生物基因组上的16S rDNA扩增并收集到一起。 universal primers: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ (E.coli bases 1507 to 1492) “TA克隆”：把每一个16S rDNA分子放到文库中的每一个克隆里。 ARDRA分型与测序 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。 Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。 此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 。 原理 双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电