第七章 化学检测ppt.pptVIP

一.前言 化学检测是根据物质的化学性质而对物质进行定性、定量测定的方法，主要包括： 1.糖类化学检测 2.蛋白质化学定量检测 3.蛋白质氨基酸序列检测 4.蛋白质免疫化学检测 5.核酸化学检测 主要的糖类化学检测技术： 1. 兰－爱农法 2. 斐林试剂快速法 3. 次碘酸钠法 4. 铜试剂法 5. 苯酚硫酸法 6. 蒽酮硫酸法 7. 3，5－二硝基水杨酸法（DNS法） 1.兰－爱农法 此法以次甲基蓝为指示剂，直接用糖液滴定到斐林试剂中进行测定； 或者将糖液加到斐林试剂中，再用标准葡萄糖液反滴定。又称置换法，直接滴定法或者次甲基蓝法。 1.1原理 糖液滴到斐林试剂中时，还原糖中的游离羰基与酒石酸钾钠铜反应，使二价铜离子还原生成一价的氧化亚铜沉淀。 由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，当二价铜离子全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液的蓝色消失，从而显示反应终点。 2.2实验操作 2.2.1斐林试剂的标定 吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶内，加10ml水，从滴定管中预先加入约20ml0.1％标准葡萄糖液，摇匀后于电炉上加热至沸，立即用标准葡萄糖液继续滴定至蓝色消失。记录消耗葡萄糖液的总毫升数V0。 2.2.2 样品含糖量测定 吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶内，加入样品稀释液10ml，及适量的0.1％标准葡萄糖液。摇匀后按标定时相同操作进行。记录消耗标准葡萄糖液的毫升数（V)。 2.2.3 计算 还原糖含量（％）＝（V0-V)*c*N/10 式中，V0——斐林试剂标定值，ml V——样品糖液测定值，ml c——标准葡萄糖液浓度，g/ml 10——样品液体积，ml N——样品稀释倍数 3.碘量法 3.1 原理 此法是利用碘与氢氧化钠反应生成次碘酸钠，氧化还原糖的自由醛基，过量的碘再用硫代硫酸钠滴定，从而测定糖的含量。 次碘酸钠氧化能力比较弱，所以只适用于醛糖的滴定，与酮糖不起反应。 4.铜试剂法 4.1 原理 铜试剂提供二价铜离子和碘，还原糖与二价铜离子反应生成的氧化亚铜被碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘，从而测定样品中还原糖的含量。 铜试剂中适当增加或减少硫酸铜和碘酸钾的量，就可测定不同范围的糖的含量。 4.2 实验操作 4.2.1 铜试剂配制 4.2.2 标准曲线制作： 4.2.2.1 配制葡萄糖标准液 4.2.2.2 取6个三角瓶，分别加入0、1、2、3、4、5ml标准葡萄糖液和5、4、3、2、1、0ml蒸馏水。 4.2.2.3 各瓶加入5ml铜试剂。置于沸水浴中加热10min，冷却至室温。 4.2.2.4 加入0.5mol/L硫酸5ml，振荡。待红色氧化亚铜沉淀完全溶解后，立即用0.005mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加数滴淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失。记录所用硫代硫酸钠毫升数。 4.2.2.5 以葡萄糖含量为纵坐标，以空白滴定值减去标准样品滴定值得出的硫代硫酸钠毫升数为横坐标，绘标准曲线。 4.2.3 样品的含糖量测定 将还原糖样品液适当稀释，取5ml样品液代替标准葡萄糖液，按上述方法进行测定。 测样品中总糖含量，则样品经过水解后，按还原糖含量测定方法进行测定。 测淀粉或半纤维素含量时，水解后测定的还原糖量要乘上系数0.9。 5.比色法测糖 上述4种糖检测方法都是通过滴定的方法进行糖含量的测量；此外，我们还可以通过比色法等检测糖的含量，主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和DNS法等，其原理分别如下： 5.1苯酚-硫酸法原理 苯酚硫酸法主要用于多糖检测。其原理是：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,随后与苯酚结合生成有色化合物,从而可以利用分光光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品中的多糖含量。 5.2 蒽酮-硫酸法原理 非还原性糖在浓硫酸催化下，迅速水解为还原糖。还原糖与浓硫酸作用形成5-羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛，与蒽酮反应生成蓝绿色物质，在625nm处有最大吸收值。 5.3 DNS法原理 3,5