第7课：重组DNA_1论述.ppt

* PUC质粒载体的优点： 基因组小，拷贝数高，DNA产量高； 有LacZ筛选标记，LacZ基因插入失活，可用蓝白斑筛选阳性克隆； 有MCS，其中有13个以上的单一限制位点，可用于外源基因克隆。 * 意义与应用 重组DNA技术的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。 * 《Frankenstein》（译作“科学怪人”或“弗兰肯斯坦”）是英国诗人雪莱的妻子玛丽·雪莱在1818年创作的小说，被认为是世界第一部真正意义上的科幻小说。“弗兰肯斯坦”是小说中那个疯狂科学家的名字，他用许多碎尸块拼接成一个“人”，并用电将其激活。《Frankenstein》已经成为科幻史上的经典，现在很多幻想类影视作品中经常出现这个怪物的翻版。 * 这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。 第一次分离出内切酶是在1970年，载体的第一次运用是在1970年，第一次分离出T4连接酶也是在这一年。 * 识别序列呈典型的旋转对称型回文结构 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 * * F因子的转移过程是：F+的菌毛接触受体细胞表面从而启动接合，进而供体与受体细胞间形成接合管，之后F因子通过滚环复制从F＋细菌转移到F－细菌（图5-16）。F因子的转移在OriT位点启动，TraY结合在OriT附近引发TraI结合，TraI作为一种松弛酶切割OriT，产生一个切口，并作为解旋酶催化约200 bp的DNA伸展。之后，5’端首先进入受体，在受体菌中转移的单链合成互补链，结果受体菌变成F+状态；供体菌则通过合成互补链来代替已转移的链，结果仍保持F+状态。 * 重组DNA（recombinant DNA ） * * 大肠埃希菌(Escherichia coli） 俗名大肠杆菌(E.coli) 是人和动物肠道中最主要的细菌之一 是正常菌群的成员- 出生后数小时就进入肠道，并伴随终生 能合成维生素B和K，供人体利用 能抑制腐败菌及病原菌（如金黄色葡萄球菌、志贺菌属）和真菌（如白念珠菌）的过度增殖 异位寄居时-可引起肠外感染 某些菌株有致病性—消化道感染，导致腹泻等 每个人每天平均从粪便中排出1011到1013个 可作为粪便污染的检测指标 常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究 基因工程的工具菌 * 生物学性状 形态与染色 G- 杆菌，1~3μm（短杆菌） 两端钝圆、无芽孢 有周鞭毛 有普通菌毛/性菌毛 -能运动 * 1、细菌培养--平板培养 划线法培养 涂布法培养 大肠杆菌的培养 * 限制性内切酶 EcoR I内切酶 限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。 分子剪刀 * 沃纳?阿尔伯 (Werner Arber) 1929年生于瑞士。苏黎士工科大学毕业后，在日内瓦大学获得博士学位。1971年起，任巴塞尔大学教授。在研究噬菌体的遗传现象时，成功地分离出DNA的限制性酶和甲基化修饰酶，为此获1978年诺贝尔生理学医学奖。 * 限制—修饰现象 K λ （B） λ （B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体 第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生长受寄主限制 K λ （K） 存活下来的噬菌体再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制 * EOP: Efficiency of plating(生长在不同寄主中的λ噬菌体的成斑率，表示限制程度)。 说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA； 10-4的存活率是由宿主限制系统作用的结果 * 产生这种现象的原因何在 甲基化酶：能使细胞自身核酸的内切酶识别序列的碱基甲基化，从而使自身核酸免受内切酶水解——细菌的“防御”系统 核酸内切酶：识别并水解外源DNA（外来核酸在内切酶识别序列上没有甲基化修饰作保护） 研究发现：原来是由两种酶配合完成，一种是起修饰作用的甲基化酶，另一种是核酸内切酶 限制 修饰 * 限制—修饰体系 K λ （B） λ （K） λ （B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体 K λ （K） 再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已经对其进行了修饰） λ （B）噬菌体感染大肠杆菌K菌株后，其DNA大部分被内切酶降解了，但有极少部分能在特定序列甲基化，避