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第三章 代谢控制发酵的基本技术 目的 掌握诱变、原生质融合、转化、转 导、杂交等代谢控制发酵的基本技术 内容 诱变、原生质融合、转化、转 导、杂 交 重点 诱变、原生质融合 难点 原生质融合、转化、转 导 学时 5 第一节：诱 变 一、诱变的概念和程序 诱变：就是利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，使其中少数细胞的遗传物质的结构发生变化，从而引起微生物的遗传性状发生变化，然后通过目的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程。 诱变程序： 出发菌株 纯化 制备菌体悬浮液 诱变剂处理 中间培养 目的突变菌株分离初筛 复筛 生产性试验 二、诱变剂 1．诱变剂的概念：能够显著地提高微生物突变频率的理化因素 2．诱变剂的种类：一般有下列两大类： 物理诱变剂：紫外线、X射线、r射线、快中子、激光、超声波等。 化学诱变剂：亚硝酸、烷化剂、羟胺、硫酸二乙酯（DES）、亚硝基胍（NTC） 、重氮化合物等 3．紫外线 诱变原理：DNA分子强烈吸收紫外线，可引起DNA的断裂、DNA分子内部和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联、嘧啶水合作用及形成嘧啶二聚体等。 诱变方法： (1)在诱变处理前，开启紫外灯，预热20min，使光波稳定。 (2)将10m1细胞悬浮液置于灭过菌的并带有磁力搅拌棒的直径的培养皿中，放置在磁力搅拌器的载物台上，紫外线照射10min进行培养皿的表面消毒 (3)开启磁力搅拌器，打开皿盖 (4)照射一定时间后，盖上皿盖，将培养皿取出，取1m1处理液稀释涂平板或中间培养。 4．亚硝酸 诱变原理：亚硝酸可以使碱基氧化脱氨，使A H 、C U、G X，从而改变了原来的碱基配对关系，引起突变。 诱变方法： (1)配制缓冲液及亚硝酸溶液灭菌备用。 2)取细胞悬浮液2m1，加入lml 0.1mo1/LNaNO2，加入1m1pH4.4醋酸缓冲液,27C保温处理一定时间。 (3) 取2m1处理液，加入pH8. 6的NaH2PO4溶液，调整PH值为7，诱变作用终止。 (4)适当稀释后徐平板或进行中间培养。 5．烷化剂 诱变原理：烷化剂能与核苷酸分子中的磷酸基，碱基起烷化作用，或与DNA分子作用造成DNA的损伤。 诱变方法：以硫酸二乙酯(DES)为例 (1)菌悬液制备 将细菌接入肉汤培养基中，振荡培养过夜。离心收集体，将细胞悬浮于PH7.0磷酸缓冲液中，制成细胞浓度为108个／mI的菌悬液。 (2)取4ml菌悬液，加入l 6mlPH 7.0磷酸缓冲液，加入0.2m1DES，30℃ 处理一定时间。 (3)取1m1处理液，放入20ml肉汤培养基中培养过夜或直接稀释徐平板。 三、诱变育种中的几个问题 1．出发菌株的选择 A 出发菌株应对诱变剂敏感、变异幅度大。 B 利用野生型菌株。 C 选用经自发突变筛选得到的菌株。 D 利用回复突变或基因重组后的菌株。 E 选择单倍体细胞。 F 选择单核或细胞核尽量少的细胞。 2．细胞悬浮液的制备 A 同步培养。 B 选择对数生长期细胞。 C 细胞悬浮液：真菌孢子和酵母菌浓度为106个/ml， 细菌营养细胞和放线菌孢子浓度为108个/ml。 D 细胞悬浮液的制备：物理诱变剂用生理盐水配制，化学诱变剂用缓冲液配制。 3．诱变剂的选择及处理方法的的选择 A 诱变剂的选择 B 诱变剂量的选择 C 诱变处理方法的选择 4．中间培养 突变基因的出现并不意味着突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象，称为表型延迟。其原因有分离性延迟和生理性延迟两种。 　　为了克服表型延迟，必须将经诱变处理的菌液进行中间培养，即将一定量的菌液接入完全液体培养基中培养过夜。 四、突变型菌株的分离 1．营养缺陷型菌株的分离 A 营养缺陷型菌株的浓缩 目的：选择性地除去经中间培养后群体细胞中的野生型细胞 方法：青霉素法、D-环丝氨酸法、五氯酚法、亚硫酸法、制霉菌素法、6-脱氧葡萄糖法、过滤法、差别杀菌法等。 B 营养缺陷型菌株的检出 目的：检出营养缺陷型菌株 方法：逐个检出法、夹层检出法、限量补充培养法、影印接种法等 C 营养缺陷型菌株的鉴定 目的：鉴定突变菌属哪种物质缺陷型 方法：在基本培养基上放置含有氨基酸、维生素、核酸水解物的滤纸片，进行培养。 2．抗性突变菌株的分离 A 抗药性突变菌株的分离 B 结构类似物抗性突变菌株的分离 3．温度敏感突变菌株的分离 4．产量性状突变菌株的分离 第二节：原生质体融合 一、概念与流程 概念：将两个遗传性状不同的细胞融合为一个新细胞 流程： 筛选标记菌株 制备原生质体