水通道蛋白1在老化退变髓核中的表达和渗透压、氧分压影响其表达的实验研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 水通道蛋白1在老化退变髓核中的表达及渗透压、 氧分压影响其表达的实验研究 刖 吾 1，AQP-1 是一类跨膜通道蛋白家族的一员，具有特异 水通道蛋白1 Aquaporin 双向水通透性。在类风湿关节炎和关节水肿中，AQP．1可能参与软骨细胞体积和 水平衡的调节。有报道发现AQP一1在正常椎间盘髓核 Nucleus Pulposus，NP 表 达，但未见其在老化退变NP的表达及可能功能的报道。细胞外环境发生不同改 变时，细胞需重构细胞外基质来维持组织结构的稳态。椎间盘细胞，尤其是NP 细胞处于一独特的细胞外环境中：低氧，酸性和持续高应力、高渗透压状态。在 老化退变的椎间盘内，细胞外基质及外环境变化，细胞必须通过不同机制，如： 主动的质膜转运，维持椎间盘的稳态。研究表明NP细胞在不同细胞外环境改变 时，其形态、功能发生显著变化，但确切机制不明确。AQP．1可能通过主动转运 小而关键的分子影响细胞与外环境的交互作用。那么髓核细胞在渗透压、氧分压 变化下发生什么样的功能改变，AQP．1对NP细胞适应这些变化能发挥什么样的 功能呢 目 的 本实验通过测定AQP．1在老化退变腰椎NP中的表达，初步探讨其在老化退 变NP的可能功能；通过观察在不同渗透压、氧分压下NP细胞表达AQP．1的差 异，初步探讨NP细胞在渗透压、氧分压改变时的反应以及AQP．1可能对NP细 胞在适应渗透压、氧分压变化时发挥的作用。 方法 1、HE和免疫组化12只日本大白兔按年龄 O．5岁青年，l岁成年，3岁老 年 分3组 n 4 。每组1只兔腰椎准备HE和免疫组化染色。每组另3只兔 用于免疫印迹分析。HE和免疫组化染色按常规步骤进行。所有结果在显微镜下 观察数码相机取相。 2、细胞培养6只成年兔用于NP细胞培养，一部分细胞种植于盖玻片上用 于HE和免疫组化染色。在不同条件下培养后，一部分细胞测定活性率，其余细 胞置于液氮中冻存，准备总RNA提取。 3、细胞活性率将用于细胞活性率计数的细胞制备成单细胞悬液，稀释。将 细胞悬液与台盼蓝溶液混匀后，短时间内分别计数活细胞和死细胞，计算细胞活 性率。 4、免疫印迹分析每组3只动物腰椎NP组织快速取出后冻存。免疫印迹分 析检测在不同年龄NP组织中，AQP．1和2型胶原的表达差异。 5、实时定量PCR用于检测NP细胞关键蛋白和AQP．1在不同培养条件下的表 达差异。 结 果 1、HE和免疫组化在青年和成年动物NP内，软骨样细胞聚集成簇，其间可见 散在小的脊索细胞。老年NP内细胞数量明显下降，脊索细胞消失，软骨样细胞肥 大。软骨样细胞和脊索细胞均表达AQP．1阳性。体外培养的NP细胞表现异型性， AQP．1和2型胶原表达阳性。 2、细胞培养和细胞活性率在单层培养早期，细胞堆积成岛状，细胞多角， 有大的突起，泡状胞质。一段时间后细胞增生为放射状。细胞融合层叠，细胞核 清晰。细胞活性率统计分析显示在不同培养条件下，NP细胞活性无差异。 3、免疫印迹2型胶原在成年和老年动物中的表达逐级显著下降。AQP．1在 成年和老年动物中均下降，以在成年动物中下降最多。 4、实时定量PCR在渗透压下降时AQP．1表达明显下调，在氧分压下降时， AQP．1表达明显上调，而在两者均下降时，AQP．1表达呈上升趋势。在渗透压／ 氧分压短期快速下降时，细胞功能受显著影响，aggrecan和2型胶原表达显著下 降，渗透压和氧分压均下降时，两者下降更为明显。 2 讨论 Sowa等研究发现随年龄增加，兔腰椎间盘髓核发生退行性改变。Xia等研究 发现，在退变的椎间盘髓核中，2型胶原的表达随着退变严重程度增加而逐渐下 降。这些与本实验在不同年龄的兔腰椎间盘中观察到的结果相似。 椎间盘老化退变降低NP细胞外渗透压。NP细胞肿胀变形，可能通过主动跨 膜转运机制以对抗之。研究表明AQP．1被阻断或抑制后，可以显著增加细胞调节 性体积下降，减少体积肿胀变形。在成年和老年动物髓核中，AQP．1均显著下降。 说明渗透压下降时，NP细胞可能通过降低水的通透性，减少体积增加。在老年动 物髓核中，AQP．1有所增加，说明存在其他因素影响AQP．1表达，作用与渗透压 相反。 正常NP细胞处于低氧环境。当椎间盘退变时，其氧分压进一步降低，严重 影响细胞功能。细胞可能通过获得02改善功能。研究表明AQP．1具有02通透性， 可能辅助细胞获得更多的02。因此，在氧分压降低时NP细胞可能通过增加AQP．1 表达以获得02，减少低氧带来的伤害。机械应力是影响椎间盘退变的另一重要因 素。随着椎间盘老化退变的发展，应力对细胞的伤害逐渐加重。Baetz等发现在 AQP．1过表达情况下，细胞对抗应力伤害的能力