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流式细胞术及其应用 第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍 概念 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM或 FACS） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点 FACSCalibur BD LSR FACS Vantage DiVa FACSAria 流式细胞仪检测范围 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 流式细胞仪的工作原理 激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 最多检测13个荧光参数 细胞分选系统 信号检测--散色光 信号检测--荧光信号 数据显示类型 光谱交叉 荧光补偿方法 抗体使用原则 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC 使用双标以上抗体必做荧光补偿 流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。 488ηm激光光源常用的荧光染料及他们的激发光和发射光波长分别是： ????????? ?激发光波长? ???发射光峰值 （ηm） （ηm） FITC （异硫氰酸荧光素） ????????488?????????????????525（绿）PE （藻红蛋白） ?? 488??????????????575（橙红）??PI? （碘化丙啶） ??? 488??????????? ??630（橙红）ECD? (藻红蛋白-得克萨斯红) ?488??????????????????610（红）CY5?? （化青素） 488????? ???????675（深红）PreCP (叶绿素蛋白) ? 488????????????????675（深红） 第 二 部 分 流式细胞术在不同领域的应用 细 胞 周 期 分 析 在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化。 正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go),? G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N，为二倍体细胞,; 处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA含量为2N-4N; 正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N)。 细胞经固定后用PI (碘化丙啶) 等荧光染料染色即可上机测定。 但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。 样品制备 建立获取模式，获取数据 （PI单染分析细胞周期，同时看凋亡） 数据分析 细胞凋亡分析 Annexin V-PE/7-AAD双染色法 人外周血淋巴细胞亚群检测 结束语 流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。 1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞 PBS漂洗 两次 70%酒精 4度固定过夜 收集固定的细胞 PBS漂洗 0.5 PBS 悬浮细胞 2.5μl 10μg/μl RNase A 37度消化1小时 过300目细胞筛 50μ