现代基因工程_05怎样获得特定基因的克隆教程.pptVIP

免疫学检测方法需要的抗体 如果把纯化后的蛋白质样品注射进兔子的血液循环系统中，它的免疫系统将产生抗体来结合和帮助降解这些外源分子[图8-17(a)]。 一旦兔子被某种外源蛋白质所激发，它血液中的足以用来纯化的高抗体水平将会持续好几天。只要10 mL的血液就能提供相当多的抗体[图8-17(b)]。 被纯化后的抗体，有特异性，只能与最初被注射进兔子体内的蛋白质相结合。 用纯化后的抗体检测重组体的蛋白质 有好几种免疫学筛查的方法，但最常用的是直接配对检出。 把重组体克隆转移到聚脂膜上，裂解细胞，再加上包含特定抗体的溶液。 为了便于检出，或者抗体本身直接标记，或者抗原抗体结合后，用标记后的蛋白A(protein A)溶液洗膜。蛋白A是一种细菌蛋白，可特异地与免疫球蛋白(抗体的主要成分)相结合。 标记可以选择放射性元素，以这种方式结合的标记将通过放射自显影而被检测出来；或者也可以用荧光或者化学发光的信号作标记。 5.4.1 互补核酸链的相互杂交 任意两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势。但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定。 但如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对的大量形成使双链分子稳定。 这一现象不仅仅发生在单链DNA分子之间形成DNA双螺旋，单链RNA分子之间以及单链RNA与单链DNA之间也可以杂交。 如果用目的基因的互补DNA或RNA作探针，就可利用核酸杂交(nucleic acid hybridization)鉴定出特定的重组体克隆。 5.4.2 用于菌落和噬菌斑的杂交探针技术 重组体DNA分子无论是存在于菌落中还是存在于噬菌斑中，都可以用杂交探针技术鉴定出来。 由于一项20世纪70年代发展而来的新技术，我们并不需要纯化每一个重组体。这项技术就是原位杂交技术。 首先把菌落或是噬菌斑转移到硝酸纤维膜或是尼龙膜上，处理除去杂质，只留下DNA。 通常以上处理步骤同时会使DNA分子变性，双螺旋之间的氢键会断裂。 如所用的是硝酸纤维膜，短时间的80℃的加热会使这些单链DNA分子牢牢结合到膜上； 如果使用的是尼龙膜，处理方法相应的改为紫外光照射。 DNA分子与膜结合的部分是它们磷酸化的五碳糖主链，这样它们的碱基是自由的，可以和互补的核酸分子配对。 方法： 然后把探针加上标签，加热变性，再加到适宜核酸退火的化学溶液中与膜结合。 经过一段时间，等杂交已经发生后，洗去没有结合的探针，干燥，现在就可以检测结合的探针的位置。 传统的方法是给探针标记上放射性的核苷酸。 标记的方法：缺口翻译、末端填平、随机引物法(random priming)[图8-10]。 其中随机引物法可以产生高活性的探针，能够探测出与膜结合得很少量的DNA分子。 用以上方法，杂交信号的位置可以通过放射自显影探测出来。 不过，放射性标记已不再流行，部分是因为它对研究人员身体的伤害，部分是因为实验产生的放射性污染物的处理问题。 已开发出来的大量的非放射性方法，图8-11解释了其中两种操作流程。 第一种方法： 使用dUTP和生物素(biotin)反应； 生物素是一种有机分子，与抗生物素蛋白(或亲和素，avidin)有很高的亲和性。 再用反应产物去标记探针，使探针带上生物素。 杂交后，用结合荧光标记的抗生物素蛋白去检出探针的位置。 这种方法与放射性标记具有相同的敏感度， 正变得越来越流行。 另一种方法： 将探针DNA分子用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)标记; 辣根过氧化物酶有降解鲁米诺(氨基苯二酰肼)的活性，同时伴有化学荧光信号的发出。 与放射自显影类似，这种荧光信号可以被普通胶卷记录下来。 5.4.3 杂交探针实际应用的例子 从菌落或是噬菌斑中鉴定某个特定重组体的方法能否成功的一个前提：是否可以得到合适的核酸分子作探针。 探针至少与被克隆的基因有着部分序列的互补性。 当试验的目的是要获得某个原本不了解的基因时，要用什么来作为探针呢? 实际上，可以通过已有的有关该基因的信息来确定探针的性质。 可以考虑以下3个可能性： (1)目标基因在某种细胞类型中高表达，可以考虑从这种特定细胞类型的文库中筛选该基因。 (2)该基因编码蛋白质的氨基酸序列已知或者部分已知。 (3)该基因属于某个已知的家族。 用高丰度重组体作探针分析cDNA文库 当我们想获得在某种类型的细胞中有相对较高的表达量的基因克隆时，则先制备该细胞的cDNA文库。 如制备正在发育的小麦种子的cDNA文库中，有相当大比例的克隆是麦醇溶蛋白基因的mRNA。 鉴定麦醇溶蛋白克隆：用文库中的某一个cDNA克隆作探针去检测文库中的其他克隆(图8-12)。 随机选择一个克隆，