siRNA干扰成纤维细胞Caveolin1基因表达对乳腺癌细胞增殖的影响和其机制探讨.pdf

摘要 摘 要 研究背景及目的 乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，已经成为城市女性健康的第一 杀手。人类对乳腺癌的相关研究已经取得很大进展，但是乳腺癌的发病诱因及 影响因素非常复杂，目前对其发病原因和发病机制仍知之甚少。Caveolin-1 蛋白 是构成细胞胞膜窖 （caveolae ）的主要蛋白，它对聚集在 caveolae 的分子具有调 控作用。Caveolin-1 与乳腺上皮细胞转化和乳腺癌发生发展密切相关，正常情况 下，Caveolin-1主要在乳腺基质成纤维细胞中表达丰富，而在慢性乳腺炎、乳腺纤 维增生及其恶性转化微环境中的基质成纤维细胞 Caveolin-1 下降甚至阴性。临床 Caveolin-1 下降或阴性的乳腺癌病人，预后差，生存率低，乳腺癌晚期病人 Caveolin-1 均为阴性，而乳腺癌 Caveolin-1 阳性的病人，预后好，生存率高，89 ％ Caveolin-1 阳性的乳腺癌患者在 l5 年的随访时间内未发生复发。细胞自噬是真核 细胞利用溶酶体对细胞器及蛋白质进行降解的生物学过程， 自噬活性改变与多 种疾病的发生发展有关，如炎症、细胞功能失调、神经变性疾病、自身免疫病、 恶性肿瘤和衰老等。肿瘤恶变微环境触发成纤维细胞上调自噬基因的表达可能 是成纤维细胞异常激活事件，使成纤维细胞的自噬功能异常，如自噬自身产生 的功能蛋白或结构蛋白，通过自噬降解大分子给癌前细胞补充营养，并通过自 噬改变细胞的分泌功能，从而修饰微环境，导致微环境中细胞的遗传不稳定性 及恶性选择，促进肿瘤的发生发展。 综上所述，本课题提出：在肿瘤微环境中，成纤维细胞内的 Caveolin-1 蛋白 和 自噬相关蛋白相互作用，从而参与调控成纤维细胞的转化和影响肿瘤细胞的 发生和发展。 本课题建立成纤维细胞 ESF 及乳腺癌细胞 BT474 共培养模型，采用 siRNA 技术干扰 Caveolin-1 基因表达，探讨成纤维细胞 Caveolin-1 与细胞自噬之间的作 用以及对乳腺癌细胞增殖的影响，期望能为乳腺癌的研究提供新的思路。 方法 1. 脂质体介导转染，qRT-PCR和Westerm Blot方法检测外源性Caveolin-1特 异性干扰RNA(siRNA Caveolin-1)介导成纤维细胞ESF的Caveolin-1转录后的基 II 万方数据 摘要 因干扰效应。 2. Transwell 方法建立乳腺癌细胞 BT474 和成纤维细胞 ESF 共培养模型。 3. CCK-8 方法检测 ESF 细胞 Caveolin-1 基因干扰和 ESF/BT474 共培养微环 境对 BT474 细胞增殖的影响。 4. 免疫荧光共聚焦激光显微镜观察 ESF 细胞 Caveolin-1 基因干扰和 ESF/BT474 共培养微环境对 ESF 细胞自噬体的影响，分析 Caveolin-1 与自噬体 之间的关系。 结果 1. qRT-PCR 和 Western-Bloting 实验结果显示，siRNA N.2 实验组 Caveolin-1 mRNA 表达水平显著低于其它各实验组（p 0.05 ）,siRNA N.1 组和 siRNA N.3 组 分别与其它各组比较，Caveolin-1 mRNA 表达水平也有显著差异（p 0.05 ）。siRNA N.1 组、siRNA N.2 组和 siRNA N.3 的 Caveolin-1 蛋白表达水平显著低于对照 组（p 0.05 ），表明 siRNA 有