蛋白质相互作用解答.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * ? 对含有特异结合位点的DNA片段进行末端标记； ? 进行DNA和蛋白质的结合反应； ? 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、干胶及放射自显影； ? 特点 ?简单、快速、具有高灵敏度和高分辨率 ?可以在DNA片段混合物中鉴别出特定DNA结合蛋白的靶序列 ?可以反映结合蛋白有否不同的亚基组合、几种不同的蛋白 之间有否相互作用以及多个蛋白竞争同一位点 ?通过加入竞争性抑制剂可以评价蛋白与DNA结合的特异性 DNA-蛋白质复合物鉴定 AP-1 oligo (cold) unrelated oligo (cold) ? DNA-protein complex AP-1 oligo (32P) ? free probe (32P) （二）滤膜结合法 利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链DNA，但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的DNA片段与游离DNA片段分离开。 （三）甲基化干扰 经甲基化修饰的DNA探针可以干扰蛋白质的结合。将DNA甲基化后与结合蛋白进行结合反应，只有在结合位点上未被修饰的DNA片段才能与蛋白结合。 DNA探针的末端标记 及探针的甲基化 蛋白质与甲基化探针的结合 及DNA－蛋白质 结合探针的分离 结合物及对照探针 的化学切割 DNA片段的序列测定 甲基化干扰实验的基本步骤 利用硫酸二甲酯(DMS)使DNA分子中的嘌呤碱基G与A发生甲基化，被甲基化修饰的G和A，会干扰DNA结合蛋白与所在部位的DNA结合；甲基化的探针可被化学试剂哌啶特异地切割，从而得到不同分子量的DNA探针片段。而与蛋白质结合着的DNA位点则不会被切割。 ? 基本原理 用特殊方法将DNA从被修饰的碱基处进行切割，并经电泳分离，由于未结合蛋白的DNA可在随机修饰的位点被切割，而有结合蛋白的DNA在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可获得蛋白质与核酸定位结合的信息。 ①将待测双链DNA片段中的一条单链的一端用放射性核素标记 ?甲基化修饰DNA探针，并使之与DNA结合蛋白反应； ?按电泳迁移率将游离DNA探针和DNA-蛋白质复合物分开，并回收 ?分别用哌啶切割后在测序聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影 ? 基本步骤 哌啶切割 DNA-蛋白质结合位点的检测 （四） DNase I足迹分析 (DNase I footprint analysis) 也称作DNase I 保护实验，是体外鉴定DNA结合蛋白在DNA分子上的结合位点的实验方法。 DNase Ⅰ足纹分析是目前广泛用于蛋白质精确结合位点的研究方法。 原理：DNase Ⅰ可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，将DNA切成单核苷酸，而结合有蛋白质的DNA免于DNaseⅠ的水解。 DNaseⅠ足纹分析原理示意图 ? 基本步骤 ? 将待测双链DNA片段中的一条单链的一端用放射性核素标记； ? 加入待测蛋白质，使之与末端标记的DNA形成复合物； ? 加入适量的DNaseI进行部分消化，使DNA断裂为相差一个核苷酸的不同片段； ? 标本经变性后在测序聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影，使之出现以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。 DNA-蛋白质结合位点的检测 DNA结合蛋白 有 无 DNA探针测序反应 （五）核酸-蛋白质杂交实验 蛋白质杂交 SDSTBE缓冲液中DNA蛋白质杂交 缓慢复性、封闭、预杂交 加入同位素标记的DNA片段作探针 多次洗膜 放射自显影 用于鉴定蛋白质与DNA的特异性结合和确定集合蛋白质的分子量。 基本步骤： 蛋白质杂交 SDS转移至NC膜或Nylon膜 缓慢复性、封闭、预杂交 加入同位素标记的DNA片段作探针 多次洗膜 Southwestern 印迹 一种核酸-蛋白质杂交实验，能够快速鉴定蛋白质与DNA的结合并测算所结合蛋白的分子量。 ? 基本原理 待测的蛋白质样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后由电印迹转移至硝酸纤维素膜上，然后加入经放射性核素标记的特定DNA片断(探针)，在相应的缓冲液中进行DNA与蛋白质的杂交,洗膜后进行放射自显影。根据标记信号的有无，即可判断待测样品中是否存在与探针DNA结合的蛋白，以及结合蛋白质的分子量。 蛋白质组学的发展促进了多种研究技术的开发和完善，越来越多的技术趋向于大规模、高通量方向发展。同时，物理学、化学、信息学等基础学科研究的发展也大大促进了这些技术的改进。新近发展的计算机分析方法，以基因序列和基因组信息为基础预测蛋白质相互作用，并涉及对参与蛋白质相互作用的表面残基的预测。依赖基因序列来分析蛋白质相互作用的分析方法正在形成。而这些先进的、简易的、大规模分析