蛋白质组学与技术第二讲解答.pptVIP

等电聚焦（Isoelectric focusing） (1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。(3)载体两性电解质： 一维等电聚焦电泳 蛋白质在不同PH值的溶液中带电荷情况是不同的，在低的PH条件下，蛋白质静电荷为正，在高PH条件下静电荷为负，在某一PH的溶液中，蛋白质的静电荷为零，则此PH值为该蛋白的等电点 蛋白质等电点取决与氨基酸的组成，是一个物理化学常数 如果外加一个电场，蛋白质会在电场作用下分别向正极和负极漂移，当达到等电点位置时，蛋白不带电，就不在漂移，这就是等电聚焦电泳的基本原理 双向凝胶电泳（2-DE）原理 Smithies和Poulik(1956 )最早引入二维电泳技术，O’Farrell（1975）根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离 二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质 双向电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿ｐＨ梯度分离至各自的等电点,随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10000个斑点(ｓｐｏｔ)。 银染已成为一种检测2- DＥ的流行方法,可检测少到2～5ｎｇ的蛋白,因此较考马斯亮蓝Ｒ- 250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色. 另有一种改良的2- ＤＥ(差异凝胶电泳),即应用两种不同的染料荧光标记两个样品,使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个,避免了几种2 -ＤＥ的比较,可在纳克级进行检测. 等电聚焦电泳 双向电泳 1D-SDSD-SDS第一向 IEF电泳 染色 第二向 SDS电泳 图像采集和分析 蛋白斑点的切取 样品制备 实验样品的制备原则 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 图象分析技术 　　 　　“满天星”式的2 ＤＥ图谱分析不能依靠本能的直觉,每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失,都可能在生理和病理状态下产生,必须依靠计算机为基础的数据处理,进行定量分析 在一系列高质量的2 －ＤＥ凝胶产生(低背景染色,高度的重复性)的前提下,图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 采集图象通常所用的系统是电荷耦合ＣＣＤ(charge coupled device) 照相机;激光密度仪(laser densitometers)和Phospho或Fluoro-imagers,对图象进行数字化 并成为以象素(pixels)为基础的空间和网格 其次,在图象灰度水平上过滤和变形,进行图象加工,以进行斑点检测. 目前双向凝胶电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(SPOT),而一个细胞系可以表达上万个基因,加上蛋白质加工修饰的多样性,一个样品中的蛋白种类可达106种。 对于一些低拷贝蛋白,通常先将蛋白粗提液通过亲和柱纯化,再由一维或二维电泳分离。单向电泳的优点在于几乎所有蛋白质均溶于ＳＤＳ,分子量在10000-300000范围内均能有效分离,极酸、极碱蛋白极易检出。 双向凝胶电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿ｐＨ梯度分离,至各自的等电点;随后,在沿垂直的方向进行分子量的分离。 蛋白质电泳图像分析 电泳凝胶后图象进行备份保存，从而以数字化图象形式存储下来，尽量完整的保留定性和定量信息以进一步分析，如总蛋白的点数，蛋白点的表达丰度的电量变化，蛋白点的缺失，利用双向电泳凝胶分析软件进行分析 LOGO 蛋白质组学与分析技术 邱德文 中国农科院植物保护研究所 第一章 蛋白质组学的概念 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，是指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质；其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 978 Cell 136, March 6, 2009 蛋白质基因互作、蛋白质受体、信号传导、调控代谢网络、作用机理、代谢途径 蛋白质的分离与纯化 蛋白质研究流程 蛋白质的分离、纯化与鉴定 功能蛋白——〉