抗真菌药物筛选模型精讲.ppt

几丁质合成酶抑制剂筛选模型 筛选方法类似于甘露聚糖合成酶抑制剂方法。 尼克霉素（nikkomycin）和多氧霉素（polyoxin）是两类几丁质合成酶抑制剂，因其结构与几丁质的前提尿苷二磷酸N-乙酰胺基葡萄糖（UDPNlcNAc）类似而竞争性抑制几丁质合成酶。 2.2.2 真菌细胞膜合成抑制剂 真菌细胞膜是一种渗透屏障，可作为小分子和信号传导的通路。 细胞膜由磷脂类、鞘脂类和固醇类物质组成，为各种功能蛋白提供基本的骨架。 2.2.2.1麦角固醇生物合成抑制剂 麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组分，在真菌生活中其重要作用。 一些不同类型的化合物通过作用于真菌麦角甾醇生物合成途径中不同环节的酶，干扰真菌麦角甾醇生物合成，发挥抗真菌作用。 2.2.2.2 鞘磷脂合成的抑制剂 鞘磷脂是真菌与哺乳动物细胞膜必要成分，借其信号传导来控制细胞的分裂、增殖和凋亡。 鞘磷脂合成始于脂肪酰辅酶A，通常软脂酰辅酶A与丝氨酸结合，这一过程受丝氨酸软脂酰转移酶酯化。 针对这一过程，目前有多球壳菌素（myriocin）、脂黄菌素（lipoxarnycin）、鞘脂菌素（sphingoffigins）和绿啶菌素（vindofungins）. 2.2.3真菌DNA和蛋白质合成抑制剂 许多癌症化疗用药或抗细胞感染系列药物如：炭疽环素（a-thracycines）、奎诺酮等均是DNA拓扑异构酶抑制剂。 筛选方法类似于抗细菌DNA旋转酶抑制剂的筛选，主要是从相应试验菌中提取酶，建立体外反应系统，检测样品对酶反应的抑制作用高低有无。 2.2.4 其他的筛选靶位 针对细胞内代谢的中间产物如核酸、氨基酸和多胺代谢； 针对微管功能如影响微管聚集或干扰微管结构完整性； 针对细胞信号传导如影响蛋白激酶和磷酸酶系统； 针对真菌繁殖周期如影响细胞分裂等； 针对真菌毒力如改变独立基因调节等。 咪唑类抗真菌药，其作用机制为抑制真菌细胞膜麦角甾醇的生物合成，影响细胞膜的通透性，抑制其生长。 抗真菌药物筛选模型 励飞小组制作 目录 1.抗真菌药物综述 1.1真菌致病特点 1.2抗真菌药物类型 1.3抗真菌药物作用机制 2.抗真菌药物的筛选方法 2.1传统的筛选方法 2.2定靶的筛选方法 1.抗真菌药物综述 1.1真菌致病特点 顽固性 广泛性 新生性 严重性 1.2抗真菌药物类型 化学合成的抗真菌抗生素 如：咪唑类，三唑类 微生物来源的抗真菌药物 如：多烯类抗生素 1.3抗真菌药物作用机制 作用于真菌细胞膜中醇合成的抗真菌药物 作用于真菌细胞壁合成的抗真菌药物 作用于核酸合成的抗真菌药物 2.抗真菌药物的筛选方法 2.1传统的筛选方法 选择毒性小的代表性真菌作为试验菌，采用管碟法或者纸片法测定样品对试验的抑制或杀伤活性。 2.1.1 管碟法 以白色 念珠菌为指示菌，对微生物进行筛选。 检测菌的培养基： 马铃薯培养基：蔗糖1.5％，马铃薯2.0％，琼脂2.0%,pH自然； 沙氏培养基：蛋白胨1.0%，氯化钠0.5％，葡萄糖4.0％，琼脂2.0％，pH自然。 发酵样品处理主要用超声处理，过滤得上清液，经过无菌过滤。 检测菌孢子制备 取冻干管中菌接种到沙氏斜面，28oC培养；白色念珠菌培养24h，表皮癣菌96h，新型隐球菌48h； 然后分别传代，培养至子三代；取孢子长势良好的子斜面1支加入灭菌生理盐水5ml，用接种环刮下孢子，转移至盛有玻璃珠的三角瓶。 同样方法处理3次，孢子液合并于三角瓶，轻轻震荡30min，然后过滤得孢子悬液。 取原液和稀释液两个浓度的孢子悬液，用血球计数仪计数，结果分别为3.6×106个/ml、3×106个/ml、5.0×106个/ml. 筛选抗真菌活性 取无菌平板加底层沙氏培养基20ml，凝固。取制得的单孢子悬液，将合适的菌液加入48oC保温的100ml沙氏培养基中轻轻摇匀。再取5ml注入底层培养基上，摇匀制成含菌平板。待平板凝固后，取4支无菌钢杯按等距离排放，一个加入酮康唑对照品，另3个加入受试样品，于28oC培养3d，观察抑菌圈。 取灭菌的300ul沙氏液体培养基，以每孔50ul的量加入到 96孔细胞培养板的个孔中；取50ul样品溶液分别加入到96孔板的第1行个孔中（从第2列开始留1列作空白对照），每1列从第1行开始依次倍半稀释到最后一孔（即第8行），然后在 28oC培养16～18h，在倒置显微镜下观察孢子生长的菌