第9章2-化学键合相色法-非极性键合相.ppt

第九章－2化学键合相色谱 正相键合相色谱 VS 反相键合相色谱 一、概 述 非极性键合相色谱，又称反相HPLC(reversed phase HPLC,RP-HPLC),或反相键合相色谱（RPBC）：硅胶表面键合了非极性有机基团(烃基硅烷)的固定相。常见的烃基有丙基、己基、辛基、十六烷基、十八烷基和苯基，其中以十八烷基键合相（简称ODS或C18）应用最广泛。 二、分离机理 1、疏溶剂作用理论 2、双保留机理 1、疏溶剂作用理论 Horvath 1976年在 “J Chromatogrphy”首次提出； “Solvophobic interactions in liquid with non-polar stationary phases,” 用于解释反相液相色谱的保留机制 1、疏溶剂作用理论 1）“分子毛” 疏溶剂作用理论认为非极性烷基键合相是在硅胶表面蒙覆了一层以Si-C键化学键合的十八烷基（或其它烃基）的“分子毛”。 溶质分子=非极性部分+极性官能团部分 3）“疏溶剂效应” ——solvophobic interaction 当溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时，相互间产生斥力。此现象称为“疏溶剂”。 当键合相表面的烷基（分子毛）与极性溶剂接触时，相互间也产生斥力。 而当溶质分子的非极性部分与键合相表面的烷基（分子毛）接触时，则相互间产生缔合作用。这种缔合作用是可逆的。这种缔合作用的强弱决定了溶质分子色谱保留的强弱。 溶质分子的极性部分与极性溶剂具有亲和力。 4）溶质保留值的影响因素 溶质分子结构对保留值的影响 烷基键合固定相特性对保留值的影响 流动相性质对保留值的影响 温度的影响 ① 溶质分子结构对保留值的影响 在一定的洗脱液和温度下，溶质分子的log k与溶质分子中的非极性部分总表面成正比。 以下是降压药盐酸非洛普及其3个代谢物的化学结构，请讨论它们在非极性键合相色谱分离分析过程中的出峰先后顺序。 烷基键合固定相特性对保留值的影响 烷基键合固定相特性对保留值的影响 例：地西泮分别在C18柱和C8柱上的色谱保留 流动相性质对保留值的影响 流动相的表面张力 流动相的表面张力越大 → 解缔合时释放的能量越多 →ｋ越大。 温度的影响 温度升高，保留值降低； 温度升高，柱效提高。 2、双保留机理 双保留机理—— 溶质的保留值应包括两部分的贡献，即疏溶剂效应和亲硅醇基效应。 “亲硅醇基效应”—— silanophilic interaction 烷基键合相表面往往还有残余硅醇基，这是一种微量酸性的基团，可与溶质阳离子或氢键基团相互作用，主要影响含氮类药物的分离，造成色谱峰拖尾，柱效下降。 解决办法 加扫尾剂。一般常用的扫尾剂为有机碱类，如三乙胺等。 三、流动相 常用流动相 1、分离中性化合物的流动相 强极性溶剂（水、醇、乙腈） 系统（2）较系统（1）好，原因如下： A ） 系统（2）的粘度较系统（1）小，柱效好些。（注：粘度↓→ 柱压↓，传质阻力↓（溶质扩散阻力↓）→ 柱效↑） B ）乙腈的紫外末端吸收较甲醇小，在低波长处测定时，基线波动较甲醇小，测定误差小。 2、反相色谱法的流动相选择 （1）二元溶剂系统 一般以洗脱能力最弱的水作为底剂，再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂构成，常用的首选极性调节剂为甲醇与乙腈。 反相HPLC改变流动相中有机溶剂比例对化合物A、B、C、D保留值的影响 （2）多元溶剂系统 在二元溶剂系统中加入少量的四氢呋喃，常能改善某些难分离的物质对的分离度。 用水、甲醇、乙腈、四氢呋喃，组成三元或四元溶剂系统，并进行优化，选出最佳溶剂系统。 流动相中加入四氢呋喃对分离度的改善 3、极性化合物的保留 离子抑制色谱 在反相色谱中常向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液，以使流动相的pH值控制在一定的数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性。 其扫尾作用，主要是有机碱与硅胶的酸性硅羟基作用，降低了硅胶的吸附作用。 流动相中加入三乙胺后对普萘洛尔在C18柱上色谱行为的影响 甲醇-水（70 ? 30） 2. 甲醇-水-三乙胺-乙酸（70 ? 30 ? 0.5 ? 0.5） 甲醇-水（40：60） 甲醇-水+三乙胺 n-普鲁卡因酰胺 普鲁卡因胺 n-普鲁卡因酰胺 普鲁卡因胺 Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 Column: HP-C18 (5?m, 120?, 4.6x250mm, 080508161