核酸分子杂交技术课程.ppt

五、杂交与杂交后检测 （一）支持介质的类型和性质 硝酸纤维薄膜： 本底低，易检测杂交信号,对小于500碱基的核酸结合力低，脆性大易破裂。 尼龙膜： 耐用，结合力强，但其本底高。 （二）核酸分子的转移 1、菌落/克隆的转移 2、从凝胶上转移DNA （1）毛细转移（虹吸原理） （2）真空转移 （3）电转移 （三）核酸的固定 1、烘烤 80℃2小时 2、紫外光固定 3、碱固定 （四）杂交 1、预杂交 （1）目的：减少非特异性杂交 （2）预杂交液的主要成分： 3、洗脱 除去溶液 未反应的探针 与滤膜疏松结合的探针 非特异性结合的探针 4、斑点杂交和狭缝杂交 （四）基因芯片技术基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系列信息。 2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，可加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃ Tm的简单计算公式： ① 20bp Tm=4（G+C）+2（A+T） ② 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% 3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加。 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度。 4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42℃杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交 五、分子杂交技术举例 液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片.（一）液相分子杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。 （二）固相分子杂交 将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶DNA的自我复性，故被广泛应用。 1、菌落杂交 用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。主要步骤： 菌落平板培养 滤膜灭菌后放到细菌平板上 菌落粘到滤膜上 滤膜放到杂交液中 探针杂交 检测 2、 Southern印迹杂交 膜上检测DNA的杂交技术，1975年由Edwin Southern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。 3、 Northern印迹杂交 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ←28S ←18S RNA电泳 （三）原位杂交1、定义： 将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交（hybridization in situ)。2、操作步骤： 载玻片的清洁与处理 组织与细胞的固定 探针 杂交 显色 镜检 * 第三讲：核酸分子杂交技术 一、概述 所谓核酸分子杂交技术就是用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将被结合核酸序列的位置或含量显示出来。 核酸分子杂交的主要用途： 1、检测标本中某一基因是否存在 2、检测标本中某一基因的表达量 二、核酸分子杂交的基本原理 基本原理：核酸的变性与复性。 三、核酸分子杂交的基本流程 收集标本 制备核酸探针 将标