NFAT1在胶质瘤中的表达和意义研究.pdfVIP

·中文论著摘要· NFATl在胶质瘤中的表达及意义研究 盏言 刖瞢 nuclearofactivatedT 研究表明，活化T细胞核因子(the factor cells，NFAT) 家族成员在许多人类恶性病变中具有肿瘤转型功能。NFATl是该家族的一个重要 成员，其活化既能够诱导T细胞的活化和增殖，又能够通过上调FasL表达，在成 cell 熟T细胞中引起“活化诱导的细胞死亡”(activation．induced death，AICD)。据 报道，NFATl和众多肿瘤细胞的存活、凋亡、迁移及侵袭相关，而NFATl在胶质 瘤中的研究尚属空白。我们以往实验显示，在多形性胶质母细胞瘤(GBM)中， 能在GBM中表达上调并且活化。如同在T细胞和其他肿瘤中，在胶质瘤细胞中， NFATl也可能调节增殖及侵袭。而影响NFATl活性的药物可能对胶质瘤产生影 响。此外，由于NFATl与免疫系统联系紧密，对NFATl的研究可能成为连接胶 质瘤化疗和免疫治疗的纽带。本研究旨在探讨NFATl在不同级别胶质瘤中的表达 情况和作用，以及相关的分子机制。 材料和方法 1、mRNA芯片分析 利用中国脑胶质瘤基因组图谱计划11 1例临床胶质瘤标本mRNA表达 聚类分析和Pearson相关分析，考察NFATlmRNA表达与侵袭相关基因表达、Fas 表达的关系。 2、RT．PCR U87、U251细胞系 通过RT．PCR进一步验证NFATl在24例GBM及GBM 中的表达。通过RT．PCR考察NFATl基因敲除对侵袭相关基因表达的影响。 3、免疫组织化学染色及免疫荧光染色 通过免疫组织化学染色法，在50例胶质瘤(25例GBM和25例星形细胞瘤) 中考察NFATl的表达和细胞内定位情况。通过免疫荧光染色，在U87细胞中， NFATl活性的影响。 4、NFATl基因沉默 RT．PCR及westemblot检测基因沉默效果。 5、细胞增殖实验 通过MTT实验及细胞计数检测细胞增殖情况，明确NFATl基因沉默对细胞 增殖的影响，以及CsA、FK506、PMA和离子霉素对GBM细胞增殖的影响。 6、体外侵袭实验 通过Transwell Matrigel实验检测细胞侵袭力。明确NFATl基因沉默对细胞 侵袭力的影响，以及CsA和FK506对GBM细胞侵袭力的影响。 7、碘化丙啶染色流式细胞仪 通过碘化丙啶(PI)染色流式细胞仪检测细胞周期、细胞死亡情况。明确NFATl 基因沉默以及PMA和离子霉素对GBM细胞周期、细胞死亡的影响。 8、透射电镜 通过透射电镜形态学观察，检测PMA和离子霉素对GBM细胞、染色质、细 胞核形态的影响。定性分析PMA和离子霉素对GBM细胞凋亡的影响。 9、TUNEL实验 细胞凋亡的影响。 10、Real．time Blot PCR和Western ， 运用real．timePCR和westemblot检测NFATl基因沉默以及PMA和离子霉 素对GBM细胞Fas／FasL表达的影响。 11、统计学分析 芯片分析获得的mRNA表达数据用于聚类分析和Pearson相关分析。聚类分析 采用average 及f检验用于检测差异显著性。所有数据由至少三次实验得到的均数4-标准差表示。 双尾P0．05认为有统计学意义。 睦里