5.9高效液相色谱法研讨.ppt

二极管阵列检测器光路图 三维色谱-光谱图 时间 波长 吸 光 度 2. 荧光检测器 （fluorescence detector FD） 原理及仪器结构与荧光分析法相同 荧光检测器的特点： (1) 灵敏度更高，比紫外检测器高3～4个数量级，检测 限可达10-12～10-14 g/ml (2) 对温度和流动相流速的变化不敏感 (3) 可进行梯度洗脱 具有荧光特性的样品 受紫外光激发后发射荧光，在一定条件下其荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系 ——选择性检测器 3. 电化学检测器 （electrochemical detector ED） 对流动相的要求： 必须含有电解质（离解常数高，在电极表面呈现惰性） 常用的是安培检测器 检测原理：测量电流与氧化还原物质的浓度成正比 ——选择性检测器 电化学检测器种类较多，有电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器 缺点： (1) 需使用缓冲液作流动相 (2) 电极寿命较短 (3) 不宜使用梯度洗脱 优点： (1) 灵敏度高，检测限可达10-12 g/ml (2) 选择性好（具有氧化还原活性的物质） (3) 线性范围宽 (4) 设备简单、成本低、操作方便 4. 示差折光检测器 （differential reflactive index detector, DRID） 优点： 操作简便 缺点： (1) 灵敏度不高 (2) 对温度变化敏感 (3) 不能用于梯度洗脱 检测原理： ——通用型检测器 利用纯流动相和含有被测组分的流动相之间折光率的差别进行检测 HPLC常用检测器主要性能 五、辅助装置 其他辅助装置： (1) 梯度洗脱装置 (2) 自动进样 (3) 数据处理系统 洗脱方式 等度洗脱 梯度洗脱 溶剂配比保持恒定 流动相组成随时间改变而改变 梯度洗脱装置 低压梯度洗脱装置 高压梯度洗脱装置 一台高压泵 不能改变流动相配比，溶剂消耗量大，自动化程度低 二台或多台高压泵 梯度重复性和精度高，自动化程度高 梯度洗脱 ( gradient elution ) 也称溶剂程序 不断改变流动相配比，使溶剂极性、离子强度或pH值改变，从而改进分离，改善峰形、缩短分析时间，以提高分离效率 对组分复杂或容量因子k范围很宽的样品分离很重要 应用HPLC对试样进行分析之前，首先要根据试样的特性来选择一种最合适的分离类型 选择色谱分离类型主要依据： 试样的分子量大小、溶解度参数和分子结构等化学性质和物理性质 一、高效液相色谱分离类型的选择 第四节 高效液相色谱法的应用 极性增加 103 102 106 104 105 相对分子质量 吸附 分配 离子交换 （反相分配） （正相分配） 排 斥 （凝胶渗透） （凝胶过滤） 非离子极性 非极性 离子 水溶 水不溶 （一）环境样品——水中污染物酚的测定 色谱条件： 色谱柱：Waters Symmetry C18 流动相：溶剂A——1%醋酸水溶液 溶剂B——1%醋酸乙腈溶液 梯度洗脱：溶剂B在20 min内经线性梯度由30%升至100% 流速：1.2 ml/min 检测器：二极管矩阵检测器 二、应用实例 （二）食物样品——孔雀石绿和结晶紫的测定 属于三苯甲烷染料类 色谱条件： 色谱柱：ODS-C18柱 流动相：乙腈＋乙酸铵缓冲溶液 流速：1.3 ml/min 柱温：35 oC 荧光检测器：激发波长265 nm，发射波长360 nm 孔雀石绿（MG）和结晶紫（GV） 混合标准的HPLC色谱图 （三）生物材料样品——尿中马尿酸(HA)和甲基马尿酸(MHA)的测定 尿样的HPLC流出图 (a)原尿样，未经经处理；(b)尿样经C18小柱处理；(c)尿样经硅胶小柱处理 色谱条件： 色谱柱：C18 流动相：甲醇-水-醋酸 紫外检测器：254 nm 甲苯和二甲苯在尿中的代谢产物 小 结 掌握HPLC的基本理论 熟悉HPLC的分类、特点及应用范围 了解HPLC和经典液相色谱法、GC的区别 了解HPLC的优点 三、离子交换色谱法 (ion-exchange chromatography) 以离子交换剂为固定相，利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的液相色谱法，主要用于离子型化合物的分离 离子交换色谱的柱填料是一种带电荷官能团的固定基质。固体基质上带负电荷的称为阳离子交换剂，带正电荷的称为阴离子交换剂 为保持交换剂的电中性，基质上还存在带相同电荷数但正、负号相反的离子，称为反离子（也称可交换离