大蒜素提取与抑菌试验方案（大蒜素实验）2.docVIP

大蒜素提取与抑菌试验方案 大蒜素液制备 提取 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种。金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 大肠杆菌 1． 1． 2 培养基。 MH 肉汤培养基（购自上海顺勃生物工程技术有限公司） 营养肉汤培养基: 牛肉膏 3 g，蛋白胨 5 g，蒸馏水1 L; 牛肉膏蛋白胨培养基: 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水 1 L。 1． 2 方法 （2）抑菌试验 1.2.2.菌悬液的制备。 1.金黄色葡萄球菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基， 2.37 ℃培养 24 h， 3.用接种环挑取形态相似菌落 3 ～5个，接种于 4 ～5 ml 的水解酪蛋白( MH) 肉汤中 4.37 ℃孵育2 ～ 6 h， 增菌后的对数生长期菌液用生理盐水配制成吸光值( OD) 为 0．1 的菌悬液 使用时稀释 10 倍。 2不同温度、PH、蒜液浓度处理实验 2.1 不同温度蒜液抑菌效果比较 1、取蒜叶称 100g 10组， 2、加 100 ml 水分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃蒸煮 30 min。 3、10组取出后分别3 500 r/min 离心 10 min， 取上层清液真空抽滤 2 次，收集滤液，过滤灭菌。 10 组大蒜液，每组每个温度分别进行抑菌圈试验。 作图：同一浓度同一PH下，不同蒜叶处理温度下的抑菌圈的大小。 2.2不同浓度蒜液抑菌效果比较 1、 取蒜粉称 100g 5 组， 2、加 100 ml 水100℃蒸煮 30 min 。 3、5 组取出后分别3 500 r/min 离心 10 min， 4、取上层清液真空抽滤 2 次，收集滤液，过滤灭菌。 5、5 组大蒜液再分别配成100%、80%、60%、40%、20% 的溶液，每组每个浓度分别进行抑菌圈试验。 6、作图：在同一个温度和PH下，不同蒜叶浓度处理的抑菌圈的大小。 2.3不同PH处理后的蒜液抑菌效果比较 1、取蒜粉称 100g 8 组， 2、加 不同PH值缓冲溶液处理，PH分别为2、3、4、5、6、7、8、9等8个PH梯度， 3、100℃蒸煮 30 min 。 4、8 组取出后分别3 500 r/min 离心 10 min， 5、取上层清液真空抽滤 2 次，收集滤液，过滤灭菌。8组大蒜液每组每个分别PH梯度进行抑菌圈试验。 6、作图：在同一个温度下，同一个浓度下，不同PH处理的蒜叶抑菌圈的大小。 1． 1． 3 试剂。 磷酸氢二钠，磷酸二氢钠（磷酸二氢钾）。 1.2.1 大蒜溶液与大蒜素的测定 取蒜叶称 10g，加 10 ml 磷酸盐缓冲液( pH 7.8) ，后3 500 r/min 离心 10 min，取上层清液真空抽滤 2 次，收集滤液，过 滤 法 灭 菌，备 用。用 定 硫 法 测 定大 蒜 素含量。 （1）大蒜素提取方案一——————定硫法 1 实验部分 1、1 测定原理 大蒜中蒜氨酸的亚砜基()SO+))和大蒜素的硫代亚砜基()SO+)S)被浓硝酸氧化成硫酸离子, 与氯化钡反应形成硫酸钡沉淀,根据硫酸钡的重量换算出大蒜素的含量。 1、2 试剂 硝酸(GR),10%氢氧化钠(AR),氯化钠(AR),甲基橙(AR)、硝酸银溶液15%氯化钡液, 1、3 测定方法 将蒜叶,准确称取5 g(精确至0.0001 g), 加浓硝酸3 ml~4 ml,用玻璃棒搅拌至黄色,放置20 min, 过滤并洗入100 ml容量瓶中,定容至刻度。 吸取滤液80 ml,放入150 ml烧杯中 ,加0.1%甲基橙指示剂5滴, 滴加10%氢氧化钠溶液至黄色,用1:1盐酸调节pH=2~3之间。 在电炉上加热微沸,趁热加入10 ml 15%氯化钡液,搅拌均匀, 在90°水浴上保温2 h, 用定量(无灰)滤纸过滤,用热去离子水洗至无氯离子(滤液加硝酸银溶液不混浊为止), 将沉淀同滤纸放入预先恒重的瓷坩锅中,低温炭化, 再放入马弗炉（电炉）中600℃灼烧至恒重,取出冷却后称重。 式中: 32.06:硫分子量; 233.39:硫酸钡分子量 ;m:硫酸钡重量; 162.26:大蒜素分子量; m0:样品重量; V0:提取液总体积; V:测定提取液体积(ml)。 1.2.3 抑菌圈法测定抑菌效果试验。 用打孔器将滤纸制成直径为 6 mm 的小圆滤纸片 干热灭菌（？如何灭菌） 在无菌操作下，将滤纸片放入样液中，浸泡 0. 5 ～1.0 h。 吸取100 μl 菌悬液于 45 ℃ 左右的牛肉膏蛋白胨培养基， 15 ml 混合摇匀，倒入培养皿中冷却制成含菌平板