22常见的细胞生物学检测技术.ppt

第22讲;基本内容;物镜测微尺--- 置于载物台 目镜测微尺--- 置于目镜;一、细胞大小的测定;一、细胞大小的测定;一、细胞大小的测定;将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度： 目微尺每格所代表的实际长度=物微尺格数/目微尺格数*10mm 　　例如：目微尺是100格，其对应的物微尺是80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100×10=8μm。测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5格，则此细胞横径为8×5=40μm。 ;;二、细胞数目的测定;;;二、细胞数目的测定;二、细胞数目的测定;操作步骤 ;操作步骤 ;（3）计数。通常以计5个中格的细胞值来代表计数室中的细胞量。将凡要计数的中格中的细胞逐一计数。计数时为了避免重复或遗漏，常将分布在格线上的菌体，一律以接触方格底线和有侧线上的菌作为计入本格内的菌数。以减少人为计数误差。将计的细胞数填入表格中。 （4）清洗。计数完毕后，记数板先用95%酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。 ;三、细胞重量的测定;三、细胞重量的测定;四、细胞活力的测定;1、四唑（zuo\）盐比色法（MTT） 优点：灵敏度高、方便 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响。MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。MTT一般最好现配现用，必须过滤除菌，避光保存，由于致癌，实验时要戴手套，倍加小心。;1、四唑（zuo\）盐比色法（MTT） 应用： 广泛用于一些生物活性因子的活性检测，大规模的抗肿瘤药物筛选，细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 ;2、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法 胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合代谢过，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。 缺点：具有放射性。;3、氯化三苯基四氮唑(TTC)法 氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80 mV 的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲腙（TTCH或TTF），比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶促反应实验的氢受体。组织中脱氢酶的活性强弱与其活力成正相关。;;;五、染色体的核型和分带;五、染色体的核型和分带; 原核生物和真核生物之间的根本区别是原核生物只有一条染色体，而大部分真核生物几乎所有的体细胞中都具有二倍体数目的染色体，即一般为两套染色体。在间期核中用光镜是看不到染色体的。在有丝分裂中期，染色体经染色后其形态和数目在光镜下酒可以观察的十分清楚。中期染色体每一个都具有两个姐妹染色单体，它们都处于高度凝聚的状态。几乎所有的细胞遗传学分析都依赖中期染色体。;正常男性核型;1. 核型：即细胞分裂中期染色体特征的总和。包括染色体的数目、大小和形态特征等方面。 2. 带型：染色体经物理、化学因素处理后，再进行分化染色，使染色体上出现明显而稳定的染色体条带。每一号染色体都有不同的带型。分带技术由于染色与预处理的方式不同可产生不同的带型，因此???G带、C带、Q带、N带和R带等不同技术。;;; G带技术是其中最常用的技术。方法是先用加热或蛋白水解酶处理未染色的中期染色体片，然后用姬姆萨染料染色，结果染色体呈现清晰、特异的G带。G带反映了染色体DNA上A-T的丰富区，在人类中约有2000条G带可被鉴别。G带不仅稳定且用扫描电镜可在带区见到收缩的痕迹。现在已制成人类的G带标准图谱。可用于鉴定染色体号数及基因定位。在植物中G带技术尚不成熟，不少植物中难以显示G带或者结果很不稳定。;G带; C带技术是和G带技术同时建立的，主要用以显示染色体中的组成型异染区，如着丝粒带。常用于植物的染色体分类。 Q带技术是将中期染色体用芥子奎吖因染色，在染色体的G带相同区域产生另外荧光带，在荧光显微镜下可以清晰地看到，虽然可以用于诊断，但受到荧光染色所限，不能长期保留。 ;C带; R带是和G带相反的带，即G带的深染区正是R带的浅染区，G带的浅染区又正是R带的深染区。R带也就是反带的意思。方法是将中期未染色的片子放在pH 4-4.5，温度为88℃的1mmol/L的NaH2PO4溶液中温育，然后再染色即可染成R带。;六、课堂小结 七、作业 细胞大小的测定方法