蛋白质化学详解.ppt

六、酶的活力测定和分离纯化;（一）　酶活力概念 由于酶容易受环境影响而失活，而且有相当一部分酶的相对分子质量是未知的，所以酶的单位用酶活力来表示。酶活力（enzyme activity）是指酶催化一定化学反应的能力, 又称为酶活性，是酶的分离纯化，酶制剂的生产中一项重要的指标。酶活力的大小可以用在一定的条件下，酶催化某一反应的反应初速度来表示。反应初速度可以用单位时间、单位体积中底物的减少量和产物的增加量来表示。因为产物的增加是从零开始，所以一般测量酶活力时都测量的是产物的增加量。反应初速度越快，即单位时间，单位体积内底物减少量越多或产物增加量越大，酶活力越高；反之，酶活力越低。;;酶活力单位 1961年，国际生物化学学会的酶学委员会，建议用“U”来表示酶活力的大小，1 U是指在特定条件下（包括最适pH值、25℃、最适底物浓度、最???缓冲液和离子强度等），1分钟内转化1微摩尔底物所需要的酶量。 1972年，国际酶学委员会又推荐了一个新的酶活力单位——Katal单位（缩写为Kat），1 Kat是指在特定条件下,1秒内能转化1 摩尔底物所需要的酶量。 1 Kat=6×107 U。 比活力是指每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位是U/mg蛋白。或者是单位质量或体积的酶活力即：U/g或U/mL。 ;（二）酶活力的测定 测定底物的消耗量或产物的生成量，通常通过分光光度计法，由于有的底物比较特殊，其底物或产物都没有特异性的生色反应，就必须用其他测定方法。这些方法有： 荧光法，同位素法，电化学方法等等，这要根据具体的酶确定。 酶活性测定尽管不要求酶的纯度，但前处理是很重要的。 ;;;同位素标记法：用放射性同位素标记底物，当酶促反应进行一段时间后，停止反应，将放射性底物和放射性产物分离，分别测定它们的放射量。通常用于底物标记的同位素有：3H、14C、131I、35S、32P等。32P、131I等能产生高能γ -射线的放射性元素可以采用Geiger 计数器（Geiger counter）来测量，而其它产生的β－射线能量低的元素，可以采用液体闪烁计数(liquid scintillation counting)来测量。该方法的优点是其灵敏度极高，达到fmol或更高水平，可以用于体内或体外酶活力的测定。但放射性元素对人体具有一定的伤害，使用时要注意安全，这种方法不能连续追踪，反应时间也不能太长。;（三）酶的分离纯化 酶的分离纯化过程与蛋白的分离纯化过程是一致的。 对分离酶要特别注意的是保持一定的低温条件和缓冲液系统。 在进行分离纯化之前，要建立酶活测定方法。随着不断纯化，总活力会下降，但比活力要提高。尽可能地提高回收率。 保存：可以是冻干保存，也可以在甘油中保存于-25—-50摄氏度。 ;;I.酶分离纯化的一般原则;1 、建立可靠和快速的测活方法;2 、酶原料的选择;3 、酶的提取;4 、酶的提纯;步骤;5 、酶的纯度检验;II、酶提取方法的选择;冻融法--生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。 渗透压法--渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗透溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。 酶消化法--利用溶酶菌、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破碎。 ;2 、抽提方法 破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行.典型的抽提液是由几部分组成：离子强度调节剂（KCl 、 NaCl 、蔗糖）+pH缓冲剂+温度效应剂（甘油、二甲基亚砜）+蛋白酶抑制剂（PMSF 、DIFP)+抗氧化剂(DTT 、巯基乙醇）+金属络合剂（EDTA 、柠檬酸）+增溶剂（TritonX-100).;;技术;技术;III、酶纯化方法的选择; 当盐浓度继续加大时，大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互凝聚而沉淀出来，这就是盐析。如硫酸铵分级沉淀。 ;;;;B.改变pH值或温度;C. 改变介电常数.; 一般，低分子量酶由于体积较小，需采用较高浓度的PEG分级；高分子量酶，分子体积较大，采用低浓度PEG级分。 PEG的另一用途就是最近发展起来的所谓‘双水相萃取’。PEG与其他一些配对使用的物质，如右旋糖酐、无机盐（磷酸钾、 硫酸铵）在水中达一定浓度时，就能形成两相系统。蛋白质在这两项中具有不同的分配系数，改变组成两相的溶质浓度就可调节各种蛋白质在两项间的分配系数，从而得到萃取分离。 ;2 、根据酶分子大小、 形状不同的分离方法 ;; 选择合适孔径的分离介质；颗粒干粉充分溶胀、脱气后装柱平衡。柱子要垂直放置，装柱完毕后，用0.2% 蓝