miR34b对人乳腺癌MDAMB231与MCF7细胞辐射敏感性影响的研究.pdf

miR-34b 对人乳腺癌 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞辐射敏感性影响的研究 中文摘要 中文摘要 目的： Ly-GDI，又称 D4-GDI、RhoGDI 2 或 RhoGDIβ，是 RhoGDP 解离抑制因子家 族的成员之一，其对细胞凋亡及侵袭等很多方面都起到调节作用。本实验构建 miR-34b 慢病毒载体，外源性恢复 miR-34b 在人乳腺癌 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞中的表达，研究其联合射线对细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响，并进一 步探讨 miR-34b 对 Ly-GDI 及其相关信号通路分子的调控作用机制。 方法： 1. 设计合成 miR-34b 前体序列，经退火及磷酸化后形成二聚体。pLentiLox 3.7 （pLL3.7）质粒经双酶切后与 miR-34b 连接，菌体 PCR 以及质粒 PCR 产物经琼脂 糖凝胶电泳验证，同时测序验证其正确性；脂质体法将构建的质粒载体与包装质 粒 pVSVG、△8.9 共转染 293T 细胞，收集病毒液并用梯度稀释法检测重组慢病毒 的滴度；用构建好的慢病毒载体感染人乳腺癌 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞并观 察感染效率。 2. 绘制 miR-34b 慢病毒感染或不同剂量 X 线照射后的细胞生长曲线；MTT 比色法和克隆形成法分析细胞增殖情况；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒染色， 流式细胞仪检测细胞凋亡情况；western blot 检测凋亡相关信号通路蛋白如 Ly-GDI 和 Bcl-2 的表达情况。 3. 体外划痕实验观察 miR-34b 联合电离辐射对 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞 运动能力的影响；Transwell 实验检测 miR-34b 联合电离辐射对细胞侵袭以及迁移 能力的影响；western blot 检测 Ly-GDI 以及相关信号通路蛋白如 MMP-2、 integrin-β1、RhoA 的表达情况。 结果： 1. 测序结果证实本实验构建的慢病毒质粒载体序列完全正确（100%匹配）， 梯度稀释法测得 pLL3.7-miR-34b 的滴度为 7.81×107 TU/mL，pLL3.7-miR-NC 的滴 I 中文摘要 miR-34b 对人乳腺癌 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞辐射敏感性影响的研究 度为 2.38×108 TU/mL；荧光显微镜观察到 pLL3.7-miR-34b 及 pLL3.7-miR-NC 对 MDA-MB-231 和 MCF-7 两种细胞的感染效率均达到了 95%以上。 2. miR-34b 慢病毒感染 3 d 后对 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞的生长有抑制作 用，并且细胞形态发生了变化；MDA-MB-231 和 MCF-7 两种细胞的生长速度分别 在受到 2、4、6 Gy X 线照射后 5、3、2 d 变慢，而且前者受到的抑制作用大于后 者；MTT 和克隆实验结果证实 miR-34b 联合射线抑制 MDA-MB-231 和 MCF-7 细 胞的增殖；流式细胞仪检测到 miR-34b 联合射线促进 MDA-MB-231 和 MCF-7 细 胞的凋亡能力；western blot 检测到 miR-34b 联合电离辐射后 MDA-MB-231 细胞中 L