第三课 转基因动物-ljl.ppt

第三课 转基因动物;提纲;第一节 概 述;转基因技术的发展;转基因小鼠技术的发展——关键技术：实现外源基因的导入及整合;1982年 – – 第一只转基因小鼠 Richard Palmiter 和 Ralph Brinster 领导的一个小组将一个能够被锌调控的DNA元件与大鼠的生长激素基因连在一起，并将其注射到了受精了的小鼠胚胎中，从而培育出了第一批转基因小鼠。这些转基因小鼠长期取食含有足量锌的食物后，就会长得非常大。转基因小鼠的出现掀起了遗传学研究的新的浪潮。 ;1983年 – – PCR Kary Mullis 发明了聚合酶链式反应（PCR），这是一种能够极其快速的获得特定DNA片段的方法。目前PCR已成了生物学实验室中的不可缺少的常规技术，在全世界都被广泛使用。Millis 因这项了不起的发明获得了1993年的诺贝尔奖。 ;1987-89年– – 第一只基因敲除小鼠 Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几个研究小组对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。这三位科学家因为这项工作在2001获得了Lasker奖。接下来，科学家们用同样的技术又培育出了几千只基因敲除小鼠。于2007年获诺贝尔奖。 ;1998年– – ?第一只克隆鼠 在1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹们。;第二节 转基因小鼠的制备原理与方法 ;第二节 转基因小鼠的制备原理与方法 ;转基因动物的 一般制备过程。;转基因动物的一般 制备过程（续）。;1.目的基因的设计; 拼接基因应用更为广泛，可通过选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性。进行基因剔除的转基因动物研究时，首先要设计与待剔除基因的同源性的载体基因，包括正负选择标志基因，通过同源重组（同源取代或同源插入）而使目的基因失活，从而建立缺基因动物。在进行基因设计时，还应设计相应的检测方法，必要时设计一个报告基因（reporter gene）。; 2．载体的选择;;;;二、外源基因导入方法 ;1、DNA显微注射技术;显微操作仪;优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观； 整合率高 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求　 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默 ; 逆转录病毒感染法是用高滴度的、携带外源基因的重组逆转录病毒感染发育早期的胚胎，再将感染病毒后的胚胎植入假孕母鼠，以产生转基因的动物。逆转录病毒的整合并不影响宿主DNA序列的重排。; 从ES（胚胎干细胞）细胞到转基因动物是从哺乳动物胚胎中分离出ES细胞，通过转导或转染的方法，将外源基因转入ES细胞，再以微注射的方式将其植入受试动物的胚胎。;ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。 将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态 在ES细胞上的基因操作： 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。; 上述三种方法各具有优缺点。显微注射法相对整合率较高（1%～10%），操作简便，易于获得成功。但外源基因通常以多拷贝串联的形式随机整合于受体基因组中，这种异常排列可能妨碍其表达的正常调节。; 显微注射法等传统的转基因技术具有随机性和不可预见性，外源基因的拷贝数和整合位点都是随机的; 逆转录病毒感染法的外源基因通常是单位点、单一拷贝整合，从而保证了外源基因结构的完整性。但整合效率较低，而且操作比较繁琐，能被导入的基因大小有一定限制（通常为10kb左右）。;优点： 外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 ;第二节 转基因小鼠的制备原理与方法 ;三、 原核注射转基因动物;以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。 ;2、报告基因 ①报告基因能够更为清晰准确地监测外源基因的时空表达。 ②报告基因都能产生各自特有的化学或发光反应 ③如：lacZ、CAT、