第三章细胞生物学研究方法-细胞生物学.ppt

本章内容提要: 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞及其组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 第五节 模式生物与功能基因组的研究;第一节 细胞形态结构的观察方法;一、光学显微镜技术 （一）普通光学显微镜 1.结构: ①照明系统 :光源和聚光器 ②光学放大系统 :物镜和目镜 ③机械装置 :用于固定材料和观察方便 ;双筒显微镜;单筒显微镜;2.原理:经物镜形成倒立实像,再经目镜进一步放大成像。;3.几个概念: ① 放大(率)倍数:显微镜最后形成的物体放大像与被检物体的大小比例, 即像高比物高。 ②分辨力(resolving power):指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力。 ③数值孔径(镜口率)（Numeric Aperture） ： NA=ｎsin(α/2);光学显微镜的分辨力 R=0.61λ/N.A． 其中λ为入射光线波长； N.A．为镜口率 ＝ｎsin(α/2)； n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。;表一、几种介质的折射率;4.显微镜的几个光学特点;(二)相差显微镜(phase-contrast microscope,PCM) 由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别。P31 在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1.环形光阑（annular diaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ ;环状光阑 　　装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体——相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40 X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。;原理图:;微分干涉显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）;;②照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上 ③有两个特殊的滤光片，激发光滤片用以滤除可见光，目镜和物镜之间的阻断滤片用于滤除紫外线，用以保护人目;荧光显微镜照片（微管呈绿色、DNA蓝色） ;（四）、激光扫描共焦显微境 ;;激光扫描共焦显微镜的特点: 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像 ，能显示细胞样品的立体结构 分辨率大约是普通光学显微镜的3倍 用途类似荧光显微镜,但能扫描不同层次,形成立体图像 扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点 ;LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 ;(五)暗视野显微镜;(六)倒置显微镜;倒置显微镜 inverse microscope ;二、电子显微镜技术(electron microscope ) （一）、透射电子显微镜 (transmission electron microscope，TEM） 1932年Ruska发明;原理:(电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样 ) 用电子束作光源，用电磁场作透镜 ,电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短. 分辨率0.2nm,放大倍数为数百万倍. 用于观察超微结构(ultrastructure),及小于0.2 μm ,光镜下无法看清的结构.;;3.制样技术: 1）超薄切片技术 :步骤:P36;莱卡超薄切片机;内质网透射电镜图;2）负染技术;3）冰冻蚀刻 (freeze-etching ): 标本置于-100度的干冰或-196度的液氮中，进行快速冰冻。 用冷刀骤然将标本断开 升温，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构-蚀刻 向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 ;冰冻断裂与冰冻蚀刻技术;（二）、扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM) 20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构. ;用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测