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第二章 光学显微技术;第二章 光学显微技术;1. 光学显微镜的发展历程;;罗伯特·虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：140倍 ;列文虎克和他的显微镜（约1680）;2. 光学显微镜的成象原理;2.1 衍射的形成;圆孔衍射;屏幕上的P1点到狭峰上边缘的距离和它到狭峰下边缘的距离之差为一个波长。 从狭峰上缘和从狭峰下缘发出的两列光波在P1点相互增强，但这两列光波不过是从连线b上发出的无数光波中的一对，其他任意两列光波到达P1点的波程差均小于一个波长。 整个狭峰内发出的光波的累计相干效果，是在P1点两侧造成一个光强的低谷，P1点位于谷底位置。 相反，在P2点处，从狭缝上缘和下缘发出的光波的波程差1? 个波长，P2成为相干增强区的中心，称为第一级衍射极大值。;衍射结果; 点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径 式中 n为介质折射率，λ照明光波长，α透镜孔径半角，M透镜放大倍数 说明埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜数值孔径成反比． ;2.2 阿贝成像原理;阿贝成像原理;物与象之间的相似性 ;放大原因;3. 光学显微镜的构造和光路图;显微镜的结构;光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course and fine focus knob) 7. 目镜(Oculars) 8. 照相机等接口(Connection to camera, etc.);目镜 目镜的作用是把物镜放大的实象再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。 聚光镜 聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。; 聚光镜光栏 所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。 聚光镜光栏作用 （1）改变聚光镜的数???孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。 （2）辅助调整亮度。 ;聚光器数值孔径;物镜 物镜(objective)是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。 (1)消色差物镜(achromat) 色差校正使可见光中红光和蓝光聚焦于一点，而黄绿光则聚焦于另一点。能够消除光谱中红光和蓝光所形成的色差。这种物镜与目镜配用时可达到消色差物镜所要求的光学性能。 (2)复消色差物镜(apochromat) 是性能最高的物镜。能消除可视光中黄、红、蓝即包括几乎所有谱线在成像过程中所造成的色差。; (3)平象物镜 它们所成的影象基本上是平的，象场弯曲很小，不会发生视野中心与边缘不能同时准焦的现象，因此对目视观察及显微摄影都极为方便。平象物镜由于将弯曲的影象展平，在同样放大倍数下它成的影象比用一般物镜要大一点。在平象物镜的金属外框上，刻有Flanachr、 planapo、 plan 等字样。? (4)相差物镜 相差物镜(Phasencontrast objective)的一个透镜片上喷涂着一层环状金属膜板叫相位板。相位板是相差显微镜的关键部件。它和相差显微镜的聚光镜上的的环状光栏相配合使用。有关位相板涂料的性质和作用原理在以后详述。 外壳上刻有Ph标记． ;物镜结构;物镜标识;4． 显微镜的重要参数;4.1 数值孔径;物镜数值孔径;4.2 分辨率;瑞利判据：当一个点光源的衍射图样的中央最亮处刚好与另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹相重合时，这两个点光源恰好能被分辨。 ;分辨本领;4.3 放大率和有效放大率;4.4 光学透镜的象差;球差校正;光学透镜的象差;色差校正;光学透镜的象差;5．样品制备;5.1取样;5.2 镶样;5.3 磨光;5.4 抛光;5.5腐蚀;本章重点