医学分子生物学-上课用-7.基因结构与表达分析方法.pptVIP

第七章 基因结构与表达分析方法;第一节 DNA序列分析 一、双脱氧末端终止法 二、化学降解法 三、DNA自动化序列分析 四、新一代DNA测序分析;一、双脱氧末端终止法;ATP、dATP和ddATP的结构;;*;*;2. DNA测序主要步骤 单链DNA模板的制备 DNA模板与测序引物退火 掺入法标记反应（如：α-35S） 延伸-终止反应 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影 阅读测序结果;二、化学降解法 将待测DNA片段3’或5’端进行同位素标记，标记的DNA片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。;*; 用荧光化合物分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。;DNA自动测序步骤 4种有不同荧光燃料标记的ddNTPs Sanger测序反应 反应产物毛细管电泳分离 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种??同波长的荧光 荧光信号采集，计算机分析与DNA自动排序;Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries ;四、新一代DNA测序技术 基于循环芯片测序法 高通量、测序成本低 焦磷酸测序法 SOLiD分析系统：准确度最高 Illumina测序仪 ;第二节 核酸分子杂交 （Nucleic Acid Hybridization） 一、核酸分子杂交原理 二、Southern印迹杂交 三、Northern印迹杂交 四、斑点杂交 五、原位分子杂交 六、液相杂交 ;一、核酸分子杂交原理 指两条互补单链核酸在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 杂交双方是探针与待测核酸序列。 探针 + 待测核酸 杂交双链;（一）印迹技术 利用各种物理方法使电泳中的生物大分子转移到硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜、化学活化膜、滤纸等各种膜上，使之成为固化分子。 （二）探针标记技术 用放射性同位素、生物素或荧光染料标记序列已知的多聚核苷酸链称为探针。;二、Southern印迹杂交（Southern blotting） 将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 用于DNA定性定量分析，基因突变分析，及RFLP分析等;提取DNA;三、Northern印迹杂交（Northern blotting） 将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及大小。 用于mRNA定性和定量分析，即基因表达分析。;优点：简单、迅速 可在同一张膜上进行多个样品的检测 核酸粗提样品的检测效果也较好;五、原位杂交in situ hybridization;核 酸 杂 交 分 类 表;与固相杂交的区别：直接在液体中杂交，不用纯化或固定靶分子，杂交步骤更简化，杂交速度有所提高，反应的敏感性和特异性更强。 1．核酸酶S1保护分析法 2．RNA酶保护分析法 ; 利用M13噬菌体合成放射性的ssDNA探针。 探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA。核酸酶S1能专一 性地降解未形成杂交的DNA和RNA单链，不降解DNA/RNA双链。 还可用于基因转录起始点分析、内含子剪切位点分析。 ;目的：检测RNA，可用于mRNA的定量分析，比Northern杂交灵敏度更高。 原理：探针为ssRNA，杂交后形成RNA/RNA，RNA酶A和T1专一性地降解ssRNA，而dsRNA不被降解。;第三节 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）;聚合酶链式反应(PCR) :;1. PCR循环由三步组成： ;5?;Cycle 3;2. PCR扩增终产物大小:;循环二;循环三; 5′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGC