第九章 蛋白质相互作用与定量蛋白质组学.pptVIP

 蛋白质相互作用与定量 蛋白质组学研究技术;蛋白质相互作用主要研究技术 酵母双杂交技术进展 TAP（Tandem Affinity Purification)技术进展 自动化、高通量酵母双杂交技术和TAP技术 定量蛋白质组学研究技术 ;一、蛋白质相互作用 Protein-Protein Interactions ; 蛋白质相互作用控制着生命过程的各个方面;Yeast Two Hybrid;二、酵母双杂交技术及进展 Yeast Two-Hybrid，Y2H. Fields S. and Song O.: Nature, 1989, 340: 245-246 研究蛋白质相互作用的方法,利用转录因子组件式（modular）结构的性质。Y2H 就是将需要研究的蛋白质设计成“诱饵”，以钓出能与诱饵蛋白发生物理相互作用的蛋白质（被捕食蛋白质）。 ;一个单转录因子有： DBD: DNA binding domain DNA结合结构域。 AD:Activation domain, 转录激活结构域：能激活RNA聚合酶起始转录。 ;;Fields S. and Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340: 245-246 ;;;;优点： 酵母细胞几乎能表达所有生物基因。 缺点： 并非所有蛋白质能在酵母核内正常 行使功能，不正确的蛋白质折叠结构： 假阳性 假阴性 ;Y2H开始以转录因子Gal4为基础，依靠 招募RNA聚合酶II激活转录。 1997：Marsoliter等建立以RNA聚合酶III 为基础的Y2H，假阳性率更低。 反向双杂交系统：reverse two-hybrid system. 构建反向筛选的报告基因（URA3，U合成所必需），蛋白质互作激活报告基因表达，使细胞不能成活。;分离杂交系统，split-hybrid system 利用2个相互整合的报告基因。 细胞质中的双杂交系统： SOS招募系统： SOS recruitment system 利用Ras信号传导途径的基本性质： 两种蛋白相互作用，就会将hSos (人的鸟苷酸交换因子)招募到膜上，激活 Ras,使酵母细胞在限制温度下成活和 增殖。;其他新的双杂交系统： 分离的泛素系统 split-ubiquitin syatem. (PNAS, 1996,91:10340-10344) 利用泛素的功能特点。 当分别与泛素N端和C端部分融合的两个蛋白质相互作用时，使分离的泛素的两部分靠近，泛素专一性的蛋白酶就会识别泛素，导致报道蛋白的解离释放。;单杂交系统，one hybrid system DNA和蛋白质间相互作用。 鉴定与特定DNA序列直接作用的蛋白质。 三杂交系统，three hybrid system RNA或小分子配体和蛋白质的相互作用 三者共同作用，才能激活转录。;三、酵母双杂交技术在蛋白质组 学中的应用 Interactome 互作组：全面详尽的蛋白质相互作用图谱。 病毒、细菌、酵母、线虫等。 T7噬菌体：首先用于大规模Y2H分析： 55个有25个相互作用。 丙型肝炎病毒HCV：编码10个成熟蛋白，有5个相互作用。 ;酿酒酵母：6000多个ORF, 1996完成 基因组计划，阵列筛选法得到281个相 互作用；文库筛选法得到692个相互作 用： Uetz,P. et al., Nature, 2000,403:623-627. 线虫：148个相互作用： Walhout A.J. et al.: Science, 2000, 287: 116-122.;四、噬菌体展示技术 （Phage display） 噬菌体展示技术是利用噬菌体的外壳蛋白与目的蛋白或多肽融合表达，将目的蛋白表达在噬菌体颗粒的外部，在蛋白质水平上进行“Biopanning”体外筛选，十分适用于酶与其配体或抑制剂、抗原决定簇、细胞表面受体的筛选等等。这个筛选的过程很简单，将目标肽或蛋白质固定于平板上，铺上噬菌体，噬菌体外壳融合蛋白与目标肽结合，不能结合的噬菌体颗粒将被洗掉，再将结合的噬菌体洗下，进行扩增培养，再进行一到两次的轮回，就能够分离到特定的噬菌体颗粒。; 噬菌体展示技术（Phage display）;五、表面等离