重组人红细胞生成素对高糖环境下体外培养HK2细胞RhoAROCK信号通路的影响.pdfVIP

摘要 摘 要 目的： 探讨重组人红细胞生成素（recombinant human erythropoietin,rhEPO）对高糖 环境下体外培养正常人肾小管上皮细胞（human kidney proximal tubular epithelial cell-2,HK-2 细胞）RhoA/ROCK 信号通路的影响，为糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）患者药物治疗寻找新的途径。 方法： 将体外培养的 HK-2 细胞按随机数字表法分为空白对照组、高糖诱导组(D- 葡萄糖终浓度 30mmol/l) 、渗透压对照组（甘露醇终浓度 24.5mmol/l）、 rhEPO 对照组(rhEPO 终浓度为 20 U/ml) 、不同浓度 rhEPO 组(rhEPO 终浓度分别为 5、 10、20 U/ml) 及 Rho 激酶抑制剂（Y27632）组 (Y27632 终浓度为 10μmol/l， 加入 Y27632 30 min 后加 D-葡萄糖，D-葡萄糖终浓度为 30 mmol/l) ，各实验组 均给予诱导时间为 24 h。光学显微镜下观察各实验组 HK-2 细胞形态学的变化。 RT-PCR 法检测各实验组 HK-2 细胞中 RhoAmRNA、ROCK1mRNA 的表达水平; 细胞免疫荧光法检测各实验组 HK-2 细胞 E-钙黏蛋白(epithelial- cadherin， E-cadherin) 、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA) 的表达情况; ELISA 法检测各实验组 HK-2 细胞培养上清液中纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、 肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor ,TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6） 等蛋白的表达。流式细胞术检测各实验组 HK-2 细胞凋亡的变化。 结果: 光学显微镜下观察 HK-2 细胞形态的变化，正常 HK-2 为椭圆形或梭形，呈 “鹅卵石”或“铺路石”样排列，给予高糖刺激后细胞胞体逐渐变长，细胞间 隙逐渐变大， 但给予不同浓度 rhEPO 或 Y27632 后，其形态学明显改善。RT-PCR 结果显示高糖诱导组 RhoAmRNA 及 ROCK1mRNA 表达较空白对照组显著升高 （P0.05）， 但分别给予不同浓度 rhEPO 干预后，RhoAmRNA 及 ROCK1mRNA 的表达显著减少（P0.05）。给予 Y27632 抑制后，RhoAmRNA 的表达较高糖诱 导组无显著性差异（P0.05），而 ROCK1mRNA 的表达则明显减少（P0.05）。 ELISA 及细胞免疫荧光结果显示高糖诱导组 FN 蛋白、α-SMA 蛋白的表达较空 白对照组明显增加（P0.05）， 但分别加入不同浓度 rhEPO 干预或 Y27632 抑制 II 万方数据 摘要 后，FN 蛋白、α-SMA 蛋白的表达明显减少（P0.05）。高糖组 E-cadherin 蛋白 表达较空白对照组明显减少，分别给予不同浓度