第五章分子生物学研究法(上)1资料.ppt

分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术;扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。;基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。;基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。;重组DNA技术发展史上的三大里程碑： 一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题。;图1-1 DNA是“转化源” ;;二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。;Generalized model of semiconservative replication of DNA. New synthesis is shown in blue.;三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。;;中心法则的演变;上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。 5.1 基因操作的基本工具 （一）限制性核酸内切酶 能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 ;图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。;Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for their work on REs. ;图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体 ;;RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n 来计算，如一个6碱基切割酶平均每4096 bp核DNA有一个酶切位点（46），而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就有一个酶切位点（44）。;重组DNA实验中常见的主要工具酶;（二）基因克隆的载体 载体三要素： 自我复制能力 携带外源基因片段大小 插入位点多少 易于鉴定识别程度;大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。;大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。;是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。;2、ColE1质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝质粒。 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。 松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。;3、pBR322质粒载体 由三个不同来源的部分组成的： 第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）； 第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）； 第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。;AmpR;优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作仍较便利。 有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。 有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积1000~3000个拷贝，便于制备重组体DNA。;获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。 ;图5-3 重组