第三讲-核酸的制备2.ppt

核酸的的制备2 核酸样品的分析与检测;一、凝胶电泳Gel electrophoresis 琼脂糖凝胶电泳 变性琼脂糖凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;1，琼脂糖凝胶电泳 一般性检测采用琼脂糖凝胶电泳：SAGEsubmerged agarose gel electrophoresis 核酸样品从负极向正极移动。 Nucleic acid samples placed in the gel will migrate towards the positive eletrode from negative electrode in horizontal direction. ;;在中性pH条件下，核酸带负电荷，主要来自磷酸二酯键骨架上的磷酸基团。 Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. multiple negative charges due to the phosphate groups on the phosphodiester backbone.;样品的分离效果与凝胶基质的孔隙度有关。随DNA分子增大，凝胶浓度应降低。 琼脂糖凝胶可以分离长度为100bp至60kb的DNA分子。 核酸染料溴乙锭。紫外线观察。 The degree of separation depended on the porosity of the matrix.;;影响泳动率的因素： 包括分子大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型。 颗粒带电荷的密度越大，泳动速度越快。 颗粒物理形状越大，与支持物介质摩擦力越大，泳动速度越小。;对于线性双链DNA分子，在凝胶电泳中，相对分子质量的常用对数与泳动率成反比关系。 利用DNA分子长度（bp）的负对数与泳动距离作图，可以方便准确地测定DNA片段的分子量。;构型相同、但相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样，在电泳过程中可以彼此分开。 相对分子质量相同的DNA分子如果它们的空间构型不同，其迁移率也不同。 质粒DNA存在闭环（Ⅰ型，CC）、单链开环（Ⅱ型，OC）和线性（Ⅲ型，L）三种构型，三者之间的迁移率一般为Ⅰ型 Ⅲ型 Ⅱ型;以pUC19质粒为例，有超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA, 简称cccDNA）、共价闭合环状质粒DNA一条单链断裂的开环质粒DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）、共价闭合环状质粒DNA两条单链断裂的线性质粒DNA（linear DNA, 简称L DNA）三种构型。 电泳时cccDNA移动最快，其次为线性DNA，开环质粒DNA最慢，所以电泳结果为三条分开的带。 限制性酶切的质粒DNA为线性分子。;; M 1 2 3 21kb 5.1 4.9 4.2 3.5 ? 2.0 1.9 1.5 1.3 0.94 0.83 ?;通常采用的缓冲体系有3种：Tris.乙酸（TAE）、Tris.硼酸（TBE）和Tris.磷酸（TPE）。 TAE缓冲能力很低，长时间电泳会导致电泳槽阴极变为碱性，阳极变为酸性，从而使缓冲能力降低。;琼脂糖凝胶电泳的分辨力较低，但它操作简便、应用范围广、适合于较大分子的分析。 DNA分子在电泳后短时间内位置可以保持不变，该技术已成为DNA、RNA分离和检测的重要手段。 TBE与TPE均有较强的缓冲能力，但从TPE凝胶回收的DNA片段中含有较高的磷酸盐，容易与DNA一起沉淀，进而影响一些酶反应，如限制性酶切反应。;琼脂糖浓度 % ;2，变性琼脂糖凝胶电泳 RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可以按大小不同而相互分开。 变性指利用变性剂破坏RNA的二级结构，消除二级结构对电泳迁移率的影响，使RNA分子的泳动由分子大小来决定。 常用的变性剂有甲醛、乙二醛和二甲基亚砜等。 ;变性凝胶也可以检测DNA分子的碱基变异： 恒定变性凝胶电泳，CDGE 瞬时温度梯度凝胶电泳，TTGE 温度梯度凝胶电泳，TGGE;3，脉冲场琼脂糖凝胶电泳 大分子DNA在电场作用下挤过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行，这样才能通过凝胶。 这时大分子通过凝胶的方式均相同，迁移率无差别，不能达到分离的目的。;当电场方向改变时，电场内的DNA分子构象也发生改变，并重新定向，沿新的方向伸直. 其转向时间与其粘弹性弛豫时间有关，并显著地依赖于分子大小。 DNA分子越大，这种构象改变需要的时间越长。;在脉冲场琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在两个不同方向的均一或不均一电场中不断随电场方向改变分子本身的构象，并挤过凝胶。;DNA分子